袋鼠精子附睾成熟过程中动态蛋白质组重塑揭示有袋类独特生殖机制

本研究针对有袋类动物辅助生殖技术(ARTs)开发瓶颈，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结合SWATH采集技术，首次系统描绘了东部灰袋鼠(Macropus giganteus)精子在附睾头(caput)、体(corpus)、尾(cauda)成熟过程中的蛋白质组动态变化。研究发现1131个差异表达蛋白，揭示附睾尾阶段出现显著的鞭毛蛋白增加和糖苷酶丢失等特征，为解释有袋类精子独特的染色质不稳定性和潜在脂质代谢偏好提供了分子依据，对优化有袋类精子冷冻保存方案具有重要指导意义。论文发表于《Biology of Reproduction》。

　　

在澳大利亚广袤的土地上，袋鼠作为标志性物种正面临栖息地丧失和气候变化的严重威胁。尽管辅助生殖技术(ARTs)在家畜中广泛应用，但由于对有袋类精子生物学认知的空白，这些技术在野生动物保护中始终难以突破。特别是精子在附睾中经历的奇妙变形过程——从睾丸释放的"T形"精子经过附睾成熟后完成头部重定位，这种有袋类特有的形态转变暗示着独特的分子重塑机制。然而，当前对袋鼠精子成熟过程的认知仍停留在显微镜观察层面，分子水平的解析几乎空白，严重制约了精子冷冻保存等关键技术的发展。

昆士兰大学(The University of Queensland)环境学院、化学与分子生物科学学院以及兽医科学学院的Sarah Kunkel、Stephen D. Johnston、Amanda Nouwens和Taylor Pini*组成的研究团队，选择东部灰袋鼠(Macropus giganteus)作为模式物种，采用先进的蛋白质组学技术首次绘制了有袋类精子附睾成熟的全景图谱。这项发表在《Biology of Reproduction》的研究不仅填补了有袋类生殖生物学的重要空白，更为开发针对性的辅助生殖技术提供了分子靶点。

研究人员采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结合数据非依赖采集(SWATH-MS)技术，对6只性成熟雄性袋鼠附睾头、体、尾三个区段的精子蛋白质组进行比较分析。通过FASP(滤膜辅助样品制备)消化样品，运用DIA-NN神经网络算法进行蛋白质鉴定和定量，结合DAVID进行基因本体(GO)功能富集分析，并与已发表的小鼠数据进行比较。

精子蛋白质组的整体特征
研究共鉴定到4,304个蛋白质，主成分分析显示附睾头与体部精子更相似，而尾部精子呈现明显差异。三区段共同高表达的29个核心蛋白中，微管蛋白(tubulins)显著富集(DAVID enrichment score 22.3)，同时包含4种组蛋白(histones)，提示有袋类精子可能保留异常高比例的组蛋白。

动态重塑的阶段性特征
比较分析揭示附睾成熟过程中1,131个蛋白质发生显著变化，其中尾部成熟阶段变化最为剧烈：

• 附睾头到体部：216个差异蛋白，无明显功能聚类
• 体部到尾部：728个差异蛋白(190增加/288减少)，鞭毛蛋白(CFAPs, dyneins)显著增加(富集分数5.8)，糖苷酶(GAA, MAN1A1等)显著减少
• 整体变化：228个蛋白在附睾头特异性表达，61个在尾部新出现

功能通路的重编程
GO分析揭示了几个关键生物学过程的变化：

• 获得性特征：鞭毛相关蛋白(富集分数19.9)、微管功能(5.5)、多种酰基辅酶A脱氢酶(ACADs)显著增加，暗示β-氧化可能作为主要能量来源
• 丢失性特征：糖苷酶(4.5)和内质网-高尔基体运输相关蛋白(3.3)减少
• 跨物种比较：线粒体蛋白(5.6)、组蛋白(3.3)在袋鼠特有蛋白中富集

讨论与意义
这项研究揭示了有袋类精子附睾成熟的几个独特机制：首先，高比例的组蛋白保留(约占25%)与已知的染色质不稳定性相符，解释了为何袋鼠精子更易受氧化应激损伤，这对改进冷冻保护策略具有直接指导意义。其次，鞭毛蛋白的阶段性增加可能通过附质体(epididymosomes)的蛋白质转移实现，这种胞外囊泡(EVs)介导的修饰方式在哺乳动物中保守但具体靶点存在物种差异。最引人注目的是β-氧化相关酶的显著增加，首次提示脂质代谢可能作为袋鼠精子的主要能量途径，这一发现将推动人工授精培养基从糖类向脂肪酸的配方革新。

研究还发现糖苷酶的减少与精子表面糖基化修饰的重塑相关，这种"边去除边添加"的动态过程可能通过EVs介导，对精子获能和受精能力具有关键影响。技术层面，采用无参基因组策略(基于考拉和袋熊蛋白数据库)的成功实践，为其他非模式物种研究提供了可行方案。

这些发现不仅解释了袋鼠精子独特的形态转变和功能获得的分子基础，更为开发针对性的精子处理介质、优化冷冻保护方案提供了具体靶点。例如，针对染色质不稳定性可添加DNA保护剂，而基于脂质代谢特点调整能量底物组合，有望显著提高冷冻精子活力。作为首个袋鼠精子蛋白质组图谱，这项研究标志着有袋类生殖生物学研究进入分子时代，为濒危物种的基因银行建设奠定了关键技术基础。