果蝇siRNA生物发生中生物分子凝聚体形成的分子机制研究

本研究揭示了果蝇(Drosophila melanogaster)小干扰RNA(siRNA)生物发生过程中Loqs-PD和Ago2蛋白通过液-液相分离(LLPS)形成生物分子凝聚体的分子机制。研究人员发现Ago2的固有无序区(Ago2IDR)在RNA存在下可形成流体状凝聚体，其稳定性依赖于精氨酸和芳香族侧链的相互作用网络。该研究为理解siRNA加工效率调控提供了新视角，可能优化dsRNA介导的抗病毒防御机制。

　　

在生命科学领域，RNA干扰(RNAi)作为一种重要的基因调控机制，在抗病毒防御和转座子沉默中发挥着关键作用。然而，关于这一精密调控系统如何在细胞内部高效有序地运行，特别是小干扰RNA(siRNA)的生物发生过程如何被精确调控，一直是科学家们探索的前沿问题。传统观点认为这一过程主要依赖于蛋白质与RNA之间的简单相互作用，但越来越多的证据表明，生物分子凝聚体的形成可能在时空组织这一复杂生化过程中扮演重要角色。

德国慕尼黑工业大学(Technical University of Munich)和路德维希-马克西米利安慕尼黑大学(Ludwig-Maximilians-University of Munich)的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表的研究，首次系统揭示了果蝇siRNA生物发生过程中关键蛋白Loqs-PD和Ago2通过液-液相分离形成生物分子凝聚体的分子机制。这项研究不仅填补了该领域的知识空白，还为理解RNAi效率调控提供了全新的视角。

研究人员运用了多项关键技术：活细胞荧光显微成像和荧光漂白恢复(FRAP)技术分析蛋白质动态；核磁共振(NMR)光谱解析蛋白质结构特征；体外相分离实验评估不同条件下的凝聚体形成；动态光散射(DLS)测量颗粒尺寸变化；电泳迁移率变动分析(EMSA)验证RNA结合能力；以及定点突变技术确定关键功能域。

研究结果部分，通过"Loqs-PD forms MLOs in cells"实验证实，Loqs-PD能在活细胞中形成具有液体特性的膜无细胞器(MLOs)，且这种形成依赖于其双链RNA结合域(dsRBDs)的RNA结合能力。荧光显微镜观察显示，GFP标记的Loqs-PD形成直径约0.2-0.4μm的细胞质斑点，FRAP实验表明约50%的蛋白可在约40秒内与周围溶液交换。

"Ago2^IDR undergoes RNA-mediated phase separation involving electrostatic interactions"部分揭示，Ago2的固有无序区(Ago2^IDR)在核酸存在下可形成液滴状凝聚体。DLS显示加入21bp发夹dsRNA后，颗粒尺寸从纳米级增至微米级。1D NMR扩散实验检测到两种不同扩散特性的状态，证实了相分离的发生。

"The Q-rich N-terminal and repeat regions are important for Ago2^IDR phase separation"研究表明，Ago2^IDR的N端多聚谷氨酰胺区和重复序列对相分离至关重要。通过构建不同截短突变体，发现重复序列数量增加会增强相分离倾向。NMR弛豫实验显示，密集相中主链动态性显著降低，但仍保持一定灵活性。

"Ago2^4-repeat forms diverse protein-protein interactions in the dense phase"通过核欧佛豪瑟效应光谱(NOESY)分析，发现密集相中存在精氨酸与酪氨酸、谷氨酸侧链间的广泛相互作用网络。同位素过滤实验鉴定出大量分子间NOE信号，表明存在复杂的相互作用网络，而非简单的"粘附-间隔"模型。

"Arginine residues are essential for Ago2^4-repeat phase separation with nucleic acids"通过系统突变分析，证实精氨酸残基对相分离具有决定性作用。将精氨酸突变为赖氨酸会显著降低相分离倾向，说明精氨酸胍基团的特异性功能。有趣的是，组氨酸突变为酪氨酸比突变为赖氨酸影响更大，表明正电荷和芳香环的共同贡献。

"Coacervation of Ago2^IDR, dsRNA, and Loqs-PD depends on Loqs-PD RNA binding"实验显示，Loqs-PD能共分配入预形成的Ago2^IDR/dsRNA液滴，但这种共凝聚严格依赖于Loqs-PD的RNA结合能力。当dsRBD的关键赖氨酸突变为丙氨酸时，Loqs-PD会被排除在液滴相外。

"The dsRNA can be cleaved by processing enzymes in the presence of condensates"证实，即使在凝聚相中，dsRNA仍可被RNase III有效切割。处理后相分离减弱，说明RNA链长度影响相分离能力，这为理解体内siRNA加工后的凝聚体解离提供了线索。

这项研究的重要发现在于揭示了果蝇siRNA生物发生过程中相分离的分子基础。Ago2^IDR通过其保守的精氨酸和谷氨酰胺富集区与RNA形成动态凝聚体，而Loqs-PD则通过其dsRBDs参与这一过程。这种相分离可能为siRNA加工提供了特异的微环境，通过局部浓缩反应组分来提高效率。特别值得注意的是，Ago2^IDR的序列特征在节肢动物中广泛保守，暗示这一机制可能在进化上具有重要意义。研究还发现，RNA加工可逆转相分离，这为理解体内siRNA生物发生的动态调控提供了新视角。这些发现不仅深化了对RNAi机制的理解，还可能为设计更高效的RNAi抗病毒策略提供理论依据。