基于硫酸-酚类显色反应的NDP-葡萄糖C2/C4差向异构酶高效检测方法开发与应用

本研究针对NDP-糖差向异构酶（NS-SDR超家族成员）筛选过程中缺乏可靠比色法的技术瓶颈，开发出硫酸-百里酚（检测NDP-甘露糖）和硫酸-1-萘酚（检测NDP-半乳糖）双重显色体系，成功应用于Ardenticatenia bacterium来源CDP-tyvelose 2-差向异构酶（AbTyvE）的生化表征，为糖基化工程提供了高效筛查工具。

　　

在糖生物学领域，核苷酸糖作为糖基转移酶的底物，是构建复杂糖链结构的关键元件。这些糖分子需要通过差向异构化等修饰反应产生结构多样性，而负责这些反应的核苷酸糖活性短链脱氢酶/还原酶（NS-SDR）超家族成员（如UDP-葡萄糖4-差向异构酶和CDP-tyvelose 2-差向异构酶）的筛选却面临两大技术障碍：底物获取困难，以及缺乏高效检测手段。传统HPLC和毛细管电泳虽精确但通量低，而现有比色法无法区分葡萄糖（Glc）与其差向异构体甘露糖（Man）或半乳糖（Gal）。

比利时根特大学的研究团队从历史文献中获得灵感，发现1946年报道的磷酸-儿茶酚显色反应与Seliwanoff试验（盐酸-间苯二酚检测果糖）存在相似原理。基于前期开发的硫酸-间苯二酚法（用于NDP-4-酮基-6-脱氧糖检测），研究人员系统筛选了16种酚类化合物与10种己糖在77%硫酸中的显色组合。通过96孔板高通量筛选，最终确立了两套特异性显色体系：80μL 77% H₂SO₄+20μL样品+2.5μL 5%百里酚乙醇液可特异性检测NDP-Man（510nm），而1-萘酚体系则专用于NDP-Gal检测。该方法成功规避了酶法检测中底物水解导致的pH冲突问题，且对核苷酸结合糖同样有效。

关键技术包括：①酚类化合物筛选（16种酚类×10种己糖组合）；②显色条件优化（硫酸浓度77%，37℃孵育30分钟）；③Ardenticatenia bacterium来源AbTyvE酶动力学分析验证。

【不同酚类与己糖在强酸条件下的反应】
研究发现百里酚与Man、1-萘酚与Gal能形成显著色差，而间苯二酚、邻甲酚等显色较弱。值得注意的是，1-萘酚在10%浓度下会析出，需调整至5%使用。

【讨论】
该研究创新性地将经典Seliwanoff反应拓展至核苷酸糖检测领域，首次实现NDP-Glc/Man与NDP-Glc/Gal混合物的比色区分。通过AbTyvE的验证实验证实，该方法所得动力学参数与文献报道高度一致，证实其可靠性。该技术不仅适用于NS-SDR超家族酶的高通量筛选，还可拓展至糖基转移酶、糖苷水解酶等研究领域。

这项由Ulrike Vogel等学者完成的工作，通过巧妙的化学方法学创新，解决了糖生物学研究中长期存在的检测技术瓶颈。相关成果发表于《Analytical Biochemistry》，为酶工程改造和稀有糖合成研究提供了强有力的工具。特别值得注意的是，该方法对核苷酸结合糖的直接检测能力，避免了传统酶法需要水解底物的局限性，展现出独特的应用优势。研究团队公开了AbTyvE表达质粒（保藏号LMBP 13892），体现了科学资源共享精神。这项技术预计将显著加速糖生物合成途径的解析与改造进程。