松材线虫生防新资源：甲壳素酶高产菌株Arthrobotrys byssisimilis的分离鉴定与作用机制研究

本研究针对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)生物防治需求，从松树小蠹虫蛀道分离获得新型捕食线虫真菌Arthrobotrys byssisimilis sp. nov.。通过多基因系统发育分析确定其分类地位，结合酶活性测定、全基因组测序和转录组分析揭示其快速杀线虫机制（10分钟100%致死率），发现104个蛋白酶和8个几丁质酶基因，为开发高效生防制剂提供新资源。

　　

松材线虫病被称为"松树癌症"，其病原体松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus, PWN)通过媒介昆虫松墨天牛(Monochamus spp.)传播，可导致松树在感染后40天内死亡。目前防治主要依赖化学杀线虫剂，但存在环境污染和抗药性问题。传统生物防治菌株如Arthrobotrys oligospora杀线虫效率较低（24小时死亡率<30%），且对松树挥发性物质耐受性差。

山东省林业科学研究院的研究团队在临沂市费县黑松(Pinus thunbergii)小蠹虫蛀道中发现一株具有特殊棉絮状菌落形态的真菌。通过ITS、TEF1-α和RPB2三基因系统发育分析，结合形态学观察，将其鉴定为Arthrobotrys属新种，命名为A. byssisimilis（意为"似棉絮的"）。研究采用酶活性测定、杀线虫实验、全基因组测序（Illumina NovaSeq平台）和差异转录组分析（DESeq2）等技术，系统评估了该菌株的生防潜力。

3.1 系统发育分析显示
基于231个scaffold组装的36.97 Mb基因组（N50=1.45 Mb）包含8,354个预测基因。多基因联合建树表明该菌株与A. dendroides和A. anomala构成姐妹群，但存在显著形态差异：分生孢子梗较短（166.5 μm vs 800 μm），分生孢子更窄（4.9 μm vs 8.5 μm）。值得注意的是，这是首次从小蠹虫蛀道分离到Arthrobotrys属真菌。

3.3 酶活性测定发现
该菌株分泌的蛋白酶在55°C/pH8时活性最高，与已知毒力因子Aoz1（最适45°C/pH6-8）特性不同。几丁质酶在25°C/pH10时活性最佳，基因组中鉴定到8个几丁质酶基因（3个分泌型），包括与AOL_379/483同源的scaffold7.t258和scaffold12.g147。

3.4-3.6 杀线虫实验证实
菌液粗提物（100%浓度）10分钟内可实现PWN全致死，显著快于已报道菌株。蛋白浓缩物（3.2 M硫酸铵沉淀）和次级代谢产物（乙醇萃取）分别在30分钟和15分钟内达到相同效果。值得注意的是，次级代谢产物在6.25%低浓度下仍保持60%杀线活性。

3.7 抗逆性测试表明
该菌株对松树挥发性物质（α-蒎烯≤5 μL、乙醇≤1%）具有显著耐受性，在含5 μL β-蒎烯的培养条件下仍能正常生长，这解释了其在小蠹虫蛀道中的生存能力。

3.8 基因组分析揭示
预测到21个次级代谢基因簇（含8个PKS），多于A. oligospora（13个）。特别鉴定到104个蛋白酶基因（62个丝氨酸蛋白酶）和218个细胞色素P450基因，其中13个P450在接触线虫后显著上调。

3.9 转录组数据显示
线虫诱导36小时后，638个差异表达基因（394上调）主要富集在应激响应（GO:0006950）和转运活性（GO:0005215）通路。值得注意的是，虽然鉴定到大量分泌型蛋白酶基因，但接触线虫后未见显著表达变化，暗示可能存在阶段特异性调控。

该研究首次报道了来源于小蠹虫生态位的高效杀线虫真菌，其快速致死机制涉及新型蛋白酶/几丁质酶协同作用和耐受松树抗菌物质的特性。全基因组分析发现的8个PKS基因簇和218个P450基因为后续开发新型线虫抑制剂提供了分子靶点。与商业菌株A. oligospora相比，A. byssisimilis在杀线速度（10分钟 vs 24小时）和环境适应性方面具有显著优势，适合开发为针叶林专用生物农药。然而，其田间应用效果仍需通过中试试验验证，特别是对非靶标线虫的生态风险评估。该研究为理解真菌-线虫-昆虫三重互作提供了新视角，拓展了捕食线虫真菌的生态位认知。