三氯生通过circRNA266/miR-214/dapk2-gad2轴干扰tecra基因剪接诱导斑马鱼神经毒性的分子机制

本研究针对环境污染物三氯生（TCS）的神经毒性机制不明问题，通过高通量测序发现circRNA266介导的ceRNA网络调控轴。研究人员证实TCS通过结合U2AF1干扰tecra基因剪接，激活circRNA266/miR-214/dapk2-gad2信号通路，导致抑制性神经递质升高和神经元凋亡。该研究首次揭示circRNA剪接调控在环境浓度TCS神经毒性中的作用，为生态风险评估提供新AOP模型。

　　

在日化产品和农业消毒剂中广泛使用的三氯生（TCS），因其环境持久性和生物累积性已成为全球性污染物。尽管已有研究报道TCS可能导致神经发育异常，但其在环境相关浓度下的分子起始事件和毒性通路仍不明确。更关键的是，传统研究多聚焦于蛋白质编码基因的调控，而对非编码RNA特别是环状RNA（circRNA）在环境毒理中的作用知之甚少。

苏州科技大学的研究团队在《Environmental Research》发表的研究中，通过整合高通量测序和分子毒理学方法，首次揭示TCS通过干扰RNA结合蛋白U2AF1与tecra基因的相互作用，异常激活circRNA266的表达。这种环状RNA作为"分子海绵"竞争性结合miR-214，解除其对死亡相关蛋白激酶2（dapk2）和谷氨酸脱羧酶2（gad2）的抑制作用，最终导致γ-氨基丁酸（GABA）能神经传递失衡和神经元凋亡。该研究不仅阐明从分子起始事件到神经行为异常的完整 adverse outcome pathway（AOP），更发现环境浓度TCS虽不引发表型异常，但已能激活关键分子事件，这对现行安全阈值评估具有警示意义。

研究采用梯度浓度暴露实验（62.5-250 μg/L），结合胚胎发育表型分析、运动行为追踪和神经组织切片。通过circRNA测序筛选差异表达分子，使用RNase R酶消化和反向PCR验证circRNA266环化结构。利用双荧光素酶报告基因和RNA pull-down证实circRNA266/miR-214/dapk2-gad2调控轴，并通过分子对接模拟TCS与U2AF1的相互作用。最后采用TUNEL染色和原位杂交定位神经细胞凋亡与circRNA266表达的空间分布。

【发育异常与行为障碍】250 μg/L TCS导致斑马鱼孵化率降低35%，出现脊柱弯曲和游泳膀胱发育延迟。行为分析显示高浓度组幼鱼运动距离减少42%，而环境浓度组（62.5 μg/L）虽无表型异常，但已检测到circRNA266上调1.8倍。

【分子机制解析】U2AF1的分子对接显示TCS可能占据其RNA结合域，破坏其对tecra pre-mRNA的正常剪接，导致circRNA266异常环化。该circRNA含有3个miR-214结合位点，其过表达使游离miR-214降低61%，进而解除对dapk2（上调2.3倍）和gad2（上调1.9倍）的抑制。

【神经毒性效应】原位杂交显示circRNA266在脑室区和脊髓束富集。TUNEL染色证实高浓度组凋亡细胞增加4.7倍，伴随gad2介导的GABA含量升高2.1倍，这与运动神经元抑制和异常游泳模式高度相关。

这项研究创新性地构建了"污染物-RNA剪接-circRNA/miRNA调控-神经毒性"的完整证据链。特别值得注意的是，环境相关浓度TCS虽不引起可见损伤，但已能干扰tecra基因的RNA剪接平衡，这种"隐性毒性"对现行以表型终点的风险评估体系提出挑战。研究提出的circRNA266/miR-214/dapk2-gad2轴为开发早期神经毒性生物标志物提供了新靶点，而U2AF1-tecra相互作用界面的发现，则为设计特异性解毒剂开辟了途径。该成果不仅推动了对环境污染物表观遗传毒性的认知，也为整合circRNA调控网络 into AOP框架提供了范式。