突破土壤基质干扰：高效提取环境监测用双链RNA(dsRNA)的创新方法

为解决土壤中双链RNA(dsRNA)提取效率低、降解严重及PCR抑制剂干扰等问题，研究人员通过优化TRI Reagent?方案，结合β-巯基乙醇(β-ME)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和硫酸铝的协同作用，开发出可回收80% dsRNA的高效方法，其qRT-PCR检测限达0.004 ng/g（沙土），为RNAi生物农药环境监测提供关键技术支撑。

　　

随着RNA干扰(RNAi)技术在农业害虫防治中的广泛应用，环境中的双链RNA(dsRNA)可能通过土壤残留影响生态平衡。然而土壤堪称"核酸黑洞"——黏土颗粒强力吸附核酸，腐殖酸等物质抑制酶反应，微生物核酸酶导致快速降解。传统TRI Reagent?法提取的dsRNA常出现降解片段（约100 bp而非目标398 bp），且含PCR抑制剂无法扩增，严重制约环境风险评估的准确性。

美国弗吉尼亚州阿尔森·H·史密斯农业研究与推广中心的研究团队针对这一难题开展研究，通过系统性优化建立了一套高效dsRNA提取方案。研究人员首先制备靶向灰霉病菌DCL1/DCL2基因的398 bp dsRNA，采用人工配制的黏土（60%黏土+30%沙+10%园土）和沙土（60%沙+30%黏土+10%园土）作为模式土壤，结合qRT-PCR定量分析，开发出三步优化策略：化学抑制（β-ME阻断核酸酶）、吸附清除（PVP结合多酚类）和选择性沉淀（硫酸铝去除腐殖酸）。关键技术包括：调整土壤-缓冲液比例（0.25 g土壤/1 mL TRI Reagent?）、优化异丙醇沉淀条件（-20°C 30分钟）、引入4 M LiCl选择性沉淀dsRNA等。

3.1 提取流程优化

初始实验显示延长裂解时间或机械珠磨会加剧dsRNA降解（图1B-C）。添加40 μL β-ME虽提高回收率（黏土124 ng/μL→沙土246 ng/μL），但PCR仍受抑制。引入0.4% PVP后电泳条带变锐利（图1E），但需250 mM硫酸铝才能彻底消除抑制剂（图2A1）。最终方案在0.25 g土壤中实现80%回收率（黏土408 ng/μL，沙土386 ng/μL），较0.5 g土壤提高近1倍（表1）。

3.2 qRT-PCR验证

针对dsRNA 5'和3'端设计两对引物（产物110 bp/98 bp），建立线性范围达5个数量级的标准曲线（R2>0.95）。残留分析显示模型拟合良好（图4），在黏土和沙土中的检测限分别为0.04 ng/g和0.004 ng/g（图3），较文献报道灵敏度提升10-100倍。

3.3 实际样本验证

对田间土壤的检测显示70%回收率，虽电泳呈拖尾（可能因微生物核酸混杂），但PCR扩增成功（图5），证实方法适用于复杂基质。

这项发表于《Environmental Technology》的研究创新性地通过铝盐沉淀攻克土壤抑制剂难题，其检测灵敏度可追踪环境残留的dsRNA分子。相比放射性标记或杂交法，该方案成本更低且适用于常规实验室，为评估RNAi生物农药的生态风险提供关键工具。研究者特别指出，对于腐殖质丰富的土壤可增加PVP用量（2-5%），而高黏土土壤建议采用磷酸盐缓冲液竞争解吸。这些发现不仅推动农业生物技术监管，也为土壤病毒组学研究开辟新途径。