长期氮肥施用对东北土壤固氮微生物群落及共生模式的转型性影响

本研究通过29年定位试验，揭示了氮肥施用对土壤固氮菌群(nifH基因)的深远影响。无机氮肥(N4)虽未改变菌群丰度，但有机无机配施(M2N2)显著提升α多样性。关键发现包括：氮积累抑制固氮酶活性(acetylene reduction法测定)，pH和有效氮(NO3--N/NH4+-N)驱动群落重构，网络分析显示施肥增强了固氮菌竞争性互作。

　　

长期氮肥施用对土壤固氮微生物的转型影响

ABSTRACT
生物固氮(BNF)是地球关键生物地球化学过程，固氮微生物在此过程中发挥核心作用。通过29年玉米田间试验，研究发现尿素单施(N4)和有机无机配施(M2N2)显著改变褐土固氮菌群结构。qPCR和高通量测序显示，M2N2处理使nifH基因拷贝数和α多样性(Shannon指数)显著提升，而氮酶活性(乙炔还原法测定)在所有施肥处理中均受抑制。

INTRODUCTION
全球约217.53 kg N ha^-1年^-1的氮肥投入引发土壤酸化、温室气体排放等问题。既往研究表明，40年化肥施用会降低细菌丰富度，而有机肥能维持群落稳定。固氮菌通过nifH基因编码的铁蛋白催化大气氮转化，其响应机制受土壤pH、有效磷(AP)等多因素调控。

MATERIALS AND METHODS
试验点位于沈阳农业大学(41°49′N)，采集0-20 cm和20-40 cm土层样本。设置3处理：对照(CK)、纯氮(N4, 270 kg N ha^-1)、有机无机配施(M2N2, 各135 kg N ha^-1)。测定指标包括：

1. 土壤性质：pH(水悬液1:2.5)、NH₄⁺-N/NO₃^--N(连续流动分析仪)
2. 固氮活性：乙炔还原法(25℃黑暗培养48h)
3. 分子分析：磁珠法提取DNA，nifH基因引物扩增后Ion S5 XL测序

RESULTS

1. 丰度与多样性
   M2N2处理nifH基因拷贝数达1.17×10⁹ copies/g，较CK显著提高。N4处理未改变α多样性，但M2N2使Shannon指数提升35%。

2. 群落结构
   施肥抑制蓝菌门(Cyanobacteria)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)，促进变形菌门(Proteobacteria)。N4处理独特富集异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)，占比超14%。

3. 环境驱动
   蒙特卡洛检验显示NO₃^--N(r=0.938)和pH(r=0.885)是群落构建关键因子。热图分析揭示30个优势属中，蓝菌属(Calothrix等)与pH正相关，而Granulicella等与有效氮负相关。

4. 共现网络
   N4处理形成最复杂网络(902条边)，负相关边占34.59%。Verrucomicrobia门的未分类属在施肥处理中成为"关键连接者"(连接度39)。

DISCUSSION

1. 活性抑制机制
   长期氮输入使潜在固氮活性降低至0.12-113.43 nmol C₂H₄ kg^-1 h^-1，与NH₄⁺-N含量(r=-0.735)显著负相关，表明氮饱和环境下固氮能耗过高。

2. 群落适应策略
   有机肥通过提供磷等元素缓解毒性效应。网络复杂性增加反映微生物通过强化互作(包括34.59%竞争关系)维持生态位。

3. 关键类群启示
   中度丰度菌(如Granulicella)在维持网络稳定性中的作用颠覆了传统"稀有类群主导"认知，为土壤微生物调控提供新靶点。

CONCLUSIONS
29年氮肥施用重塑了土壤固氮微生物的生存策略：在活性受抑背景下，菌群通过结构重组和网络复杂化实现功能补偿。该研究为农业氮素管理提供了微生物学依据，特别揭示了有机无机配施在维持土壤微生物功能方面的优势。