新型天然乳清发酵剂原型系统的开发及其在帕尔马干酪PDO生产中对青霉素G残留影响的研究

为解决帕尔马干酪PDO生产中天然乳清发酵剂(NWS)因反复回添(back-slopping)导致的微生物群落波动问题，研究人员开发了一种冻干原型发酵剂系统(NSC0)，通过三批次实验室规模干酪制作验证，发现≤4 ppb青霉素G(PEN G)会抑制乳酸菌(LAB)活性并降低微生物多样性，其中乳酸杆菌(L. delbrueckii)和链球菌(S. thermophilus)最敏感，而嗜热链球菌(L. helveticus)表现抗性。该研究为预测复杂发酵剂行为提供了可控研究平台。

　　

在传统奶酪制作中，天然乳清发酵剂(Natural Whey Starter, NWS)的微生物群落稳定性直接影响产品品质。帕尔马雷吉亚诺PDO奶酪(Parmigiano Reggiano PDO)作为意大利标志性硬质奶酪，其生产规范严格要求使用新鲜NWS，并通过回添工艺(back-slopping)每日制备。然而，这种依赖环境微生物的发酵系统存在显著波动性，尤其是当原料乳中含有抗生素残留时，可能破坏发酵剂微生物平衡。更棘手的是，现行法规允许的抗生素最大残留限量(MRL)是否足以保护发酵剂功能尚不明确，而传统研究方法又难以在不干扰实际生产的情况下开展对照实验。

针对这一行业痛点，来自意大利的研究团队创新性地开发了冻干原型天然发酵剂系统(Natural Starter Culture, NSC₀)，成功模拟了帕尔马干酪生产中的回添过程。这项发表在《Food Microbiology》的研究首次揭示了青霉素G(PEN G)在≤4 ppb浓度下对NWS微生物群落的累积抑制效应，特别是发现不同乳酸菌种对β-内酰胺类抗生素存在显著差异敏感性。

研究人员采用冻干技术稳定了两种典型NWS微生物群落（以L. helveticus为主型-H和含L. delbrueckii型-D），通过优化复活条件（45°C/16h）获得活性相当的NSC₀。在三轮实验室规模干酪制作中，利用血球计数板监测总微生物数(TMC)，结合选择性培养基（MRS pH 5.4/6.5和M17-SSW）进行菌落计数，并采用SYTO 9/PI荧光染色评估细胞活性。关键突破是应用物种特异性qPCR（靶向pheS基因）定量L. helveticus、L. delbrueckii和S. thermophilus的基因组拷贝数，揭示了抗生素的种属特异性影响。

3.1 冻干NWS实验室复活方法的验证

通过比较变温(VT)与恒温(CT42/CT45)复活方案，发现45°C/16h条件最佳，可使冻干后的型-H和型-D NSC₀保持>80%存活率，乳酸菌数达8 Log₁₀ CFU/mL，与新鲜NWS性能相当。

3.2 单次及连续干酪制作的SW发酵

三轮回添实验证实，虽然凝乳加热(55°C)会使甜乳清(SW)中微生物减少1.5 Log₁₀单位，但发酵后NSC_1-3的发酵活性(FA)和微生物数量均能恢复至NSC₀水平，证明系统稳定性。

3.3 单次干酪制作中PEN G的影响

4 ppb PEN G虽不影响最终酸度(TA)，但使型-H NSC₁的FA降低28.5%，链球菌数减少0.75 Log₁₀，酵母污染增加2.83 Log₁₀，显示亚MRL浓度已可破坏微生物平衡。

3.4 多次干酪制作中PEN G的累积效应

连续暴露使2-4 ppb PEN G产生剂量依赖性抑制：型-H NSC₃中L. delbrueckii基因组拷贝数下降1.5 Log₁₀，而L. helveticus始终保持抗性，证实种间敏感差异。

3.5 qPCR物种定量分析

绝对定量显示4 ppb PEN G使型-H NSC₂中S. thermophilus减少1.2 Log₁₀，而型-D群落因初始组成不同表现出更强耐受性，揭示群落结构对抗生素压力的缓冲作用。

这项研究构建的首个NWS可控研究平台，不仅证实了欧盟现行MRL标准在反复回添场景下的技术缺陷，更揭示了PEN G通过选择性抑制L. delbrueckii和S. thermophilus导致微生物多样性丧失的机制。特别值得注意的是，L. helveticus的天然抗性可能解释了某些帕尔马干酪工厂NWS自发向单一种群演化的现象。研究发现酵母在LAB受抑时的爆发性增长，也为解释发酵失败提供了新视角。该原型系统未来可用于研究更多影响NWS的生态因子，为传统发酵食品的标准化生产提供科学依据。