基于群体感应动态调控系统的枯草芽孢杆菌重组酶高效分泌策略开发

本研究针对枯草芽孢杆菌重组蛋白分泌效率低的瓶颈问题，创新性构建了QS-LytC群体感应动态调控系统，通过精确调控细胞壁水解酶lytC表达，使纤维二糖2-差向异构酶(CE)的胞外活性提升至70.21%，总酶活达12.50 U·mL?1，并验证了该系统在FAST-PETase和GDH分泌中的普适性，为工业酶制剂生产提供了新策略。

　　

在工业生物技术领域，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因其卓越的蛋白分泌能力和GRAS(公认安全)认证，成为重组酶生产的明星宿主。然而，细胞壁这道天然屏障却严重制约着大分子物质的胞外分泌效率。传统静态调控方法往往导致细胞生长与蛋白分泌的失衡，如何实现"破壁"与"存活"的精准平衡，成为困扰学界多年的技术难题。

山东大学(根据CRediT声明推测)的研究团队独辟蹊径，从细菌的"社交语言"——群体感应(Quorum Sensing, QS)中获取灵感，创造性地将LuxRI信号系统与细胞壁水解酶lytC基因的时序表达相耦合，构建出智能响应菌群密度的动态调控系统QS-LytC。这项发表于《International Journal of Biological Macromolecules》的研究，通过启动子工程优化基础表达水平，采用时间控制型自溶策略，最终实现了重组酶分泌效率的突破性提升。

研究团队运用了三大关键技术：启动子替换策略筛选高效表达元件、LuxRI-QS系统构建细胞密度感应模块、生长阶段特异性诱导lytC表达的时序调控技术。通过比较P₄₃与P_HpaII启动子驱动下的CS-CE表达差异，证实强启动子可使总酶活提升至8.43 U·mL^?1。在此基础上引入QS-LytC系统，通过延时激活细胞壁修饰机制，使纤维二糖2-差向异构酶(Cellobiose 2-epimerase, CE)的胞外分泌比例从55.37%跃升至70.21%，且总酶活增幅达48%。

【主要研究发现】

1. 启动子优化效应：P₄₃启动子使CE总活性较原始载体提高1.8倍，证实转录强度是限制产量的关键因素。

2. QS-LytC时空控制：系统在培养24小时后自动激活lytC表达，通过精确调控N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性，实现细胞壁通透性的阶段性增强。

3. 多酶普适性验证：在FAST-PETase(聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶)和GDH(葡萄糖脱氢酶)中分别实现81.29%和83.00%的胞外活性，证实系统不依赖特定酶特性。

4. 细胞活性保护：延时启动策略使活菌数保持在10⁸ CFU·mL^?1以上，破解了分泌增强与细胞存活不可兼得的困局。

这项研究开创性地将微生物群体行为调控机制转化为精准的代谢工程工具，其创新价值体现在三个维度：技术层面建立了可编程的蛋白分泌放大器，理论层面揭示了细胞壁动态修饰与产物分泌的量化关系，应用层面为工业酶制剂生产提供了通用型解决方案。特别是对乳果糖等稀有糖生物合成中关键酶CS-CE的产量提升，直接推动了功能性食品添加剂的生产革新。研究展现的"感知-响应"智能调控理念，更为其他微生物细胞工厂的构建提供了范式转移的新思路。