基于SYBR green qPCR技术的西洋参园土壤中伊氏镰刀菌（Ilyonectria radicicola）检测方法开发与应用

本研究开发了一种高灵敏度、高特异性的SYBR green qPCR检测方法，可精准定量西洋参（Panax quinquefolius）重茬病害关键病原菌——伊氏镰刀菌（Ilyonectria radicicola clade）在土壤中的DNA拷贝数（最低检测限2.5 fg/μL），通过三年田间试验验证其与植株密度呈显著负相关（R2=0.75），为病害风险评估提供了分子工具。

　　

摘要

本研究针对北美高价值药用作物西洋参（Panax quinquefolius）的重茬病害问题，开发了基于SYBR green染料的实时定量PCR（qPCR）检测技术。通过设计特异性引物（Ily_ITSF1/R1）靶向病原菌Ilyonectria mors-panacis的核糖体ITS区5.8S序列，实现了对土壤中Ilyonectria radicicola分支成员的高灵敏度检测（纯培养DNA检测限2.5 fg/μL，土壤样本87拷贝/μL）。该技术对Fusarium等常见土传病原菌无交叉反应，但可检测近缘种Cylindrocarpon didymum（Ct值19.1±2.6）。

材料与方法

病原菌培养与DNA提取：采用PDA培养基培养I. mors-panacis菌株，通过珠磨破碎和FastDNA SPIN Kit提取基因组DNA。

田间试验设计：在加拿大安大略省Norfolk县的重茬病害高发区设置6种预处理方案（含未处理对照），采用随机区组设计（RCBD）采集2020-2022年土壤样本（10g/样本），使用DNeasy PowerMax Soil Kit提取总DNA。

qPCR优化：引物设计基于Nectriaceae VI分支15个物种ITS区多重比对，反应体系含SYBR Green supermix，退火温度64°C，40个循环后通过熔解曲线验证特异性。

结果

灵敏度验证：标准曲线显示检测线性范围8.7×10⁴-8.7×10⁵拷贝/g土壤（Ct值24.3-33.0），PCR效率达97.7%。

田间监测数据：处理3（专利方案）显著降低病原菌载量（2022年Ct值31.9±0.8），而未处理组Ct值持续低位（26.7±1.0）。

病害相关性：病原菌DNA拷贝数与植株密度呈显著负相关（2021年R²=0.75），两年内植株数从996株/1.62m²锐减至367株。

讨论

该研究突破了传统培养法的局限性，首次建立可直接定量土壤中Ilyonectria菌群的分子工具。尽管存在土壤抑制剂干扰等挑战，但大样本量（10g土壤）提取策略有效反映了田间病害梯度。与Farh等人开发的组蛋白H3特异性qPCR联用，可进一步解析I. radicicola分支的种群动态。研究结果为西洋参种植前的土壤风险评估提供了关键技术支撑，对保障高价值药用作物可持续生产具有重要意义。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容，专业术语如RCBD、Ct值等均按原文格式保留）