分离、鉴定并表征一种具有抗Burkholderia contaminans活性的海洋Lactiplantibacillus plantarum菌株

《Frontiers in Microbiology》：Isolation, identification, and characterization of a marine Lactiplantibacillus plantarum strain with antimicrobial activity against Burkholderia contaminans

厌氧菌的分子进化机制及在环境修复中的应用前景。

　　本研究探讨了一种新型的生物抗菌策略，以应对一种名为 *Burkholderia contaminans* 的机会性病原菌在食品、化妆品和制药工业中带来的潜在威胁。该细菌是一种革兰氏阴性、需氧、不形成孢子且不发酵的微生物，广泛分布于自然环境中，如土壤和水体。由于其广泛的适应性和潜在致病性，*B. contaminans* 被认为对人类健康、生态系统和工业生产构成严重威胁。在食品工业中，该菌可能导致食品腐败和食源性疾病，并与某些细菌性食物中毒事件相关。此外，它还能产生多种毒素，引发感染，如败血症和肺炎，对免疫力低下的人群尤其危险。在化妆品行业中，*B. contaminans* 可以利用配方中的营养物质大量繁殖，影响产品质量并导致外观、气味和质地的改变。暴露于受污染的化妆品可能引发皮肤不良反应，如红肿、瘙痒和皮疹。因此，监管机构如美国和欧盟已将其列为化妆品中不可接受的微生物，并规定成品中不得检出该菌。

在工业生产过程中，若卫生管理不当或设备受到污染，*B. contaminans* 可能通过水源、生产线或包装材料进入产品系统，带来显著的安全风险。该菌对传统消毒方法表现出较强的抗性，例如对大多数抗生素（包括β-内酰胺类、第三代和第四代头孢菌素及氟喹诺酮类）的耐受性，使得其彻底清除变得困难。此外，某些 *Burkholderia* 菌株对临床常用消毒剂如 Hibiscrub 也表现出耐受性，部分菌株在接触 1 小时后仍能存活。目前，控制 *B. contaminans* 的策略主要包括物理方法（如加热或辐射）和化学或药物方法（如使用强力霉素和复方磺胺甲噁唑）。然而，这些方法存在明显的局限性，例如高温或辐射可能影响产品质量，而化学药物可能导致不完全灭菌，且抗生素的使用在食品和化妆品中受到严格限制。此外，抗生素的滥用加剧了抗微生物耐药性的产生，使传统治疗手段在几年内失效。因此，亟需开发高效、安全且成本低廉的抗菌策略，以满足不同领域的应用需求。

近年来，生物抗菌方法，特别是利用拮抗微生物的策略，因其生态安全性和较低的耐药风险而受到广泛关注。然而，能够有效抑制 *B. contaminans* 的细菌种类仍不明确。本研究聚焦于一种广泛研究的益生菌——*Lactiplantibacillus plantarum*，因其具备多种功能特性，包括抗菌活性、调节肠道菌群、免疫调节和抗氧化作用。*L. plantarum* 广泛应用于食品、医药、益生菌和农业领域。与传统的物理、化学和药物抗菌方法相比，*L. plantarum* 具有更高的生物相容性和安全性。近年来，*L. plantarum* 及其代谢产物因其抗菌活性而受到更多关注，成为新型生物抗菌剂的潜在候选者。特别是来自海洋的 *L. plantarum* 及其他乳酸菌，由于适应了海洋环境中的高盐度、高压和低温等严酷条件，可能具有比陆地菌株更强的抗菌潜力。这些环境压力促使它们合成独特的代谢产物，这些代谢产物具有更高的稳定性和生物活性。例如，从海洋海鲈鱼养殖池中分离出的 *Lactobacillus plantarum* EI6 菌株表现出广谱抗菌活性，并能耐受低pH和高盐浓度。

本研究从海洋海鲈鱼养殖池中分离出一株对 *B. contaminans* 具有抗菌活性的菌株，并鉴定为 *L. plantarum* Dys01。该菌株的抗菌活性主要来源于其代谢产物，最小抑菌浓度（MIC）为 8 mg/mL。进一步分析表明，该菌株的抗菌物质主要包括有机酸、蛋白质类物质和过氧化氢，其中有机酸和蛋白质类物质在抑制 *B. contaminans* 中起主导作用。此外，*L. plantarum* Dys01 的代谢产物显著抑制了 *B. contaminans* 的生物膜形成，且具有剂量依赖性。通过碱性磷酸酶活性测定和碘化丙啶（PI）染色实验，发现代谢产物能够破坏 *B. contaminans* 的细胞壁和细胞膜完整性。这一结果进一步通过扫描电子显微镜（FESEM）验证，显示了 *B. contaminans* 细胞表面出现凹陷和膜破裂等典型形态学损伤。因此，本研究为控制食品、化妆品和制药行业中的 *B. contaminans* 污染提供了新的视角，并为开发新型生物防腐剂奠定了重要的理论基础。

在材料与方法部分，研究人员从海鲈鱼肠道和养殖池沉积物中采集样本，并使用 MRS 培养基进行菌株分离。通过氧化杯法评估菌株对 *B. contaminans* 的抗菌活性，筛选出具有显著抑制作用的菌株 Dys01。该菌株的菌落形态为圆形、小而白色，表面光滑且湿润，具有一定的粘附性。进一步通过 16S rRNA 基因测序和系统发育分析确认其分类为 *L. plantarum*，并将其与已知菌株进行比对，发现其与 *L. plantarum* MT611725.1 的相似度高达 99.93%。这表明 Dys01 是一种典型的 *L. plantarum* 菌株。

为了确定 Dys01 菌株代谢产物的抗菌效果和 MIC，研究人员采用了两倍稀释法进行测定。结果显示，当代谢产物浓度达到 8 mg/mL 时，*B. contaminans* 的生长被显著抑制，培养基保持澄清。而当浓度为 4 mg/mL 时，*B. contaminans* 仍能显著生长，导致培养基变浑浊。因此，确定 Dys01 菌株代谢产物对 *B. contaminans* 的 MIC 为 8 mg/mL。

为进一步分析代谢产物的抗菌成分，研究人员分别对代谢产物进行了三种处理：加入过氧化氢酶去除过氧化氢、加入酸性蛋白酶分解蛋白质类物质，以及通过调整 pH 值中和有机酸的作用。实验结果表明，中和有机酸后，抗菌效果显著下降，抑制率减少了 37.63%；而蛋白酶处理后，抑制率下降了 21.27%；过氧化氢酶处理后，抑制率仅下降了 9.6%。这些结果表明，有机酸和蛋白质类物质在 *L. plantarum* Dys01 代谢产物中起主要作用，而过氧化氢的作用相对较小。因此，代谢产物的抗菌作用主要由有机酸和蛋白质类物质的协同效应所驱动。

为了评估代谢产物对 *B. contaminans* 生物膜形成的影响，研究人员采用了 96 孔板法进行生物膜抑制实验。结果显示，当代谢产物浓度为 0.5 × MIC 时，生物膜形成受到显著抑制，抑制率达到 37.3%；当浓度提高到 1 × MIC 和 2 × MIC 时，抑制率分别达到 52.2% 和 65.2%。这些数据表明，*L. plantarum* Dys01 的代谢产物能够以剂量依赖性的方式显著抑制 *B. contaminans* 的生物膜形成。生物膜的形成是细菌在多种环境压力下增强存活能力的重要机制，因此，抑制其形成对于控制 *B. contaminans* 的传播和致病性具有重要意义。

为了进一步探讨代谢产物对 *B. contaminans* 细胞壁和细胞膜完整性的破坏作用，研究人员进行了碱性磷酸酶（AKP）活性测定和 PI 染色实验。在 AKP 活性测定中，当代谢产物浓度为 1 × MIC 和 2 × MIC 时，AKP 活性显著增强，而 0.5 × MIC 时则略有提升。这表明代谢产物能够以剂量依赖性的方式破坏 *B. contaminans* 的细胞壁结构，导致细胞壁通透性增加，从而释放 AKP 活性。PI 染色实验显示，代谢产物浓度越高，染色强度越强，表明细胞膜受损越严重。这些实验结果进一步验证了代谢产物对 *B. contaminans* 的抗菌作用不仅限于抑制其生长，还包括破坏其细胞结构，导致细胞膜和细胞壁的完整性受损。

通过扫描电子显微镜（FESEM）观察 *B. contaminans* 在不同代谢产物浓度下的形态变化，研究人员发现，随着代谢产物浓度的增加，细菌细胞的形态逐渐发生破坏。在 0.5 × MIC 条件下，细胞表面出现轻微的粗糙和细小的皱纹，细胞间的间隙略微扩大，开始表现出分散的趋势；在 1 × MIC 条件下，细胞表面出现明显的孔洞，细胞体积显著缩小，表面沟壑加深，形态变得不规则，细胞间结构更加松散；而在 2 × MIC 条件下，细胞结构严重破坏，细胞形态明显变形和破碎，表面出现明显的裂痕和裂解迹象。这些形态学变化进一步支持了代谢产物对 *B. contaminans* 的抗菌机制，即通过破坏细胞膜和细胞壁，导致细菌死亡。

讨论部分强调了 *B. contaminans* 在医院环境和工业设备中的广泛分布及其强大的环境适应性和潜在致病性。该菌的生物膜形成能力使其能够稳定附着于多种表面，并形成结构屏障，增强其对抗生素、防腐剂和其他环境压力的耐受性。因此，开发基于微生物及其代谢产物的新型生物抗菌策略成为当前研究的重点。近年来，海洋环境和水生动物肠道被广泛认为是功能性益生菌的重要天然资源。这些微生物适应了高盐度、高压和营养丰富的极端环境，表现出卓越的环境适应性和复杂的次级代谢途径，从而能够合成多种具有生物活性的抗菌代谢产物。例如，从海参养殖环境中分离的 *L. plantarum* CLY-5 菌株对 *Vibrio splendidus* 和 *Pseudoalteromonas* 等病原菌具有显著的广谱抗菌活性；而从鱼类肠道和湖泊水体中筛选出的 *Lactococcus lactis* 不仅对 *Aeromonas hydrophila* 具有显著的抑制作用，还表现出良好的附着和定植能力。这些研究结果表明，海洋来源的乳酸菌在病原菌控制和水产养殖中的应用潜力巨大。

在本研究中，研究人员从海鲈鱼肠道中分离并鉴定出 *L. plantarum* Dys01 菌株，并发现其对 *B. contaminans* 具有显著的剂量依赖性抗菌作用。尽管已有研究显示 *L. plantarum* 能够有效抑制如 *Staphylococcus aureus*、*Escherichia coli* 和 *Salmonella* 等多种病原菌，但本研究首次揭示了其对 *B. contaminans* 的抗菌活性。这一发现为食品和化妆品行业中 *B. contaminans* 的防控提供了新的理论依据。

研究进一步揭示了代谢产物的抗菌机制。有机酸通过渗透细胞膜并酸化细胞质，破坏细菌的 pH 平衡，导致 H? 的主动外排，消耗 ATP，同时交换钾离子，增加渗透压，最终导致细胞膜破裂和细胞内容物泄漏。此外，有机酸还能干扰或阻断核 DNA 合成，破坏与能量生产相关的代谢转录过程，并使关键细胞内酶变性，从而导致细胞死亡。某些有机酸（如柠檬酸、草酸和酒石酸）还能阻断细菌表面粘附蛋白的合成，抑制其定植和生物膜形成。蛋白质类物质则通过与细胞膜上的特定受体结合，干扰细胞膜的结构稳定性，进而导致细胞膜通透性增加和细胞内容物外泄。过氧化氢则通过其强氧化性，引发自由基反应，导致细胞膜脂质过氧化，破坏细胞膜结构，并产生有毒副产物如丙二醛（MDA）和 4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）。这些副产物与细胞内蛋白质和核酸相互作用，导致酶失活、基因损伤以及细胞膜和细胞壁的完整性破坏。尽管一些乳酸菌分泌催化酶（如过氧化氢酶）以减轻自身对氧化产物的敏感性，但本研究显示，*L. plantarum* Dys01 的代谢产物能够通过抑制生物膜形成和破坏细胞壁、细胞膜结构，显著降低 *B. contaminans* 的存活率。

本研究的局限性在于目前仍处于实验室规模，需要进一步优化和纯化 *L. plantarum* Dys01 的代谢产物，以便与商业防腐剂和抗生素进行比较，并在工业环境中应用。尽管如此，研究结果仍为食品卫生和生物防腐剂的开发提供了重要的理论基础。通过揭示 *L. plantarum* Dys01 代谢产物对 *B. contaminans* 的抗菌机制，本研究为开发新型生物抗菌策略提供了新的思路。未来的研究可进一步探索代谢产物中具体抗菌成分的鉴定和定量，并深入研究其抗菌机制，以期为实际应用提供更明确的指导。此外，随着对海洋微生物资源的不断开发，越来越多的抗菌潜力可能被发现，为食品安全和工业防腐提供更加丰富的生物资源。