气相色谱法用于分析和测定来自Aurantiochytrium limacinum的脂肪酸中天然丰度水平的13C，该菌是多不饱和脂肪酸的可持续来源

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Gas chromatography for analysis and estimation of 13C at natural abundance level in fatty acids produced from Aurantiochytrium limacinum, a sustainable source of polyunsaturated fatty acid

DHA作为ω-3多不饱和脂肪酸，对神经退行性疾病和眼部疾病有显著益处。本研究以A. limacinum ATCC MYA-1381为对象，优化其培养基条件，通过GC-FID分析发现，对数期DHA占比达65.6%，稳定期降至33.9%，同时检测到DPA（45.4%）等新代谢产物。采用GC-C-IRMS结合CSIA技术，首次揭示该阶段δ13C值变化范围为-8.3‰至-18.5‰，证实代谢通量差异与同位素分馏直接相关。该研究为微藻高值化DHA生产及代谢动力学解析提供了新方法。

　　本研究聚焦于一种名为*Aurantiochytrium limacinum*（A. limacinum）的微生物，这是一种在生产多不饱和脂肪酸（PUFAs）方面具有潜力的生物资源，特别是二十碳六烯酸（DHA，C22:6n-3）。DHA作为一种ω-3脂肪酸，广泛存在于人类大脑和眼睛中，具有多种健康益处，尤其在预防和治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病方面发挥重要作用。此外，DHA还与眼部健康密切相关，是食品和制药行业的重要成分。因此，研究如何高效、环保地生产DHA成为当前生物技术领域的重要课题。

A. limacinum属于异养的海洋原生生物，属于Stramenopiles类群，能够在各种环境中生长，包括海洋、河流、湖泊，甚至在干旱的沙漠和水库中生存。这种生物具备较强的环境适应能力，能够耐受温度、盐度、pH值和光照强度等变化。其显著的优势在于能够合成大量PUFAs，特别是DHA，这使其成为一种理想的生物资源。此外，A. limacinum还能生产其他有价值的生物活性化合物，如酚类物质、类胡萝卜素和多糖等，这些物质在食品、医药和化妆品领域具有广泛的应用前景。

本研究的主要目标是优化A. limacinum ATCC MYA-1381（称为SR21株）的培养条件，并通过GC-FID分析其脂肪酸（FAs）组成。同时，研究团队还引入了一种新型的化合物特异性同位素分析（CSIA）方法，利用GC-C-IRMS技术在自然同位素丰度水平下测定脂肪酸的碳同位素组成（δ13C值）。通过这种分析，研究人员能够追踪脂肪酸的代谢命运，从而深入了解其生物合成过程中的碳流动和同位素分馏模式。这一技术在生物医学研究中具有潜在的应用价值，尤其是在与DHA相关的神经退行性疾病研究中。

为了实现上述目标，研究团队首先对A. limacinum进行了培养条件的优化。细胞生长情况通过光学密度（OD???）、细胞计数和葡萄糖浓度进行监测。细胞在指数生长期和稳定生长期被分别收集，并采用一种绿色的提取方法获取脂质。随后，脂肪酸甲酯（FAMEs）被制备并利用GC-FID进行分析。结果显示，在指数生长期，DHA是主要的脂肪酸，占总脂肪酸的65.6%，其次是棕榈酸（C16:0），占34.4%。而在稳定生长期，二十碳五烯酸（DPA，C22:5n-3）和DHA分别占45.4%和33.9%。此外，十四烷酸（C14:0）、十四烷烯酸（C14:1n-9）和棕榈酸在稳定生长期的含量分别为4.6%、6.2%和9.9%。这些结果表明，随着培养阶段的变化，脂肪酸的组成发生了显著的改变，这种变化可能与细胞代谢路径的调整有关。

进一步的CSIA分析显示，所有FAMEs的δ13C值均为负值，表明它们在碳同位素组成上存在明显的贫化现象。这与A. limacinum在自然碳同位素条件下生长有关，因为它们主要依赖12C标记的葡萄糖作为碳源。在指数生长期，C16:0和DHA的δ13C值分别为?16.8 ± 0.2和?18.5‰ ± 0.1‰，而在稳定生长期，C14:0、C14:1n-9、C16:0、C22:5n-3和DHA的δ13C值分别为?10.6 ± 1.1、?11.3 ± 0.1、?11.1 ± 0.2、?8.3 ± 0.2和?10.6‰ ± 0.1‰。这些数据不仅揭示了脂肪酸的代谢路径，还提供了关于细胞在不同生长阶段如何分配碳资源的线索。

通过分析这些同位素数据，研究团队发现，DHA在指数生长期的δ13C值比稳定生长期更加负，这可能意味着在指数生长期，细胞更倾向于将12C碳源优先用于DHA的合成。而在稳定生长期，由于葡萄糖浓度下降，细胞可能开始利用内部的碳储备，这些碳源可能具有更高的13C丰度，从而导致DHA的同位素值上升。此外，DPA在稳定生长期的δ13C值相对较低（?8.3‰），这可能与DPA在脂肪酸合成中的中间角色有关，例如它可能作为DHA合成的前体。DHA的合成通常涉及Δ4脱饱和酶，而DPA则可能通过延长酶和Δ6脱饱和酶的作用从二十碳四烯酸（ETA）或花生四烯酸中生成。在稳定生长期，由于营养物质的限制，Δ4脱饱和酶的活性可能下降，导致DPA的积累，进而影响其同位素特征。

这些结果不仅对理解A. limacinum的脂肪酸代谢具有重要意义，还为研究其他微藻的同位素分馏模式提供了参考。此外，本研究还强调了CSIA技术在追踪脂肪酸代谢命运方面的应用潜力。该方法能够揭示不同代谢路径的碳流动情况，为优化脂肪酸合成效率、提高DHA产量提供理论依据。同时，研究结果还表明，GC-C-IRMS技术在微藻系统中的应用能够有效支持对碳代谢路径的深入研究，尤其是在探讨碳源利用效率和代谢流变化方面。

本研究还对培养条件进行了优化，包括培养基的成分、培养时间、温度、搅拌速度等。通过添加抗生素（如氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素）来防止细菌污染，同时采用微波辅助提取技术（MAE）来提取脂质，这种方法能够减少溶剂的使用，提高提取效率，并减少对环境的影响。细胞的培养过程中，葡萄糖的消耗情况被监测，并用于判断指数生长期和稳定生长期。结果显示，指数生长期的细胞仅消耗了约5.5%的葡萄糖，而稳定生长期的细胞消耗了约51%的葡萄糖。这表明，在稳定生长期，细胞的代谢活动更加活跃，且葡萄糖的消耗速率显著提高。

此外，本研究还对不同培养阶段的细胞生物量进行了测量。在指数生长期，细胞生物量为72 ± 8 mg，而在稳定生长期，细胞生物量增加至197 ± 36 mg。这表明，随着培养时间的延长，细胞的生长趋于饱和，但脂质的积累却持续增加。脂质的总产量在稳定生长期达到102 mg，占细胞干重的约52%，这与文献中报道的A. limacinum在稳定生长期积累脂质（尤其是PUFAs）的能力相符。这种高脂质含量使得A. limacinum成为一种理想的生物资源，用于可持续的DHA生产。

本研究的结果强调了A. limacinum作为微生物平台在环保生产PUFAs方面的可行性。同时，研究团队开发的CSIA方法在追踪脂肪酸代谢命运方面具有显著的应用价值，尤其是在生物医学研究中，尤其是在涉及DHA的神经退行性疾病领域。通过分析脂肪酸的同位素特征，研究人员可以更准确地了解不同代谢路径的碳流动情况，从而为优化脂肪酸合成提供科学依据。此外，这些数据还可以用于研究不同微藻在不同生长阶段的代谢特征，为生物技术应用提供更全面的视角。

本研究的意义不仅在于对A. limacinum的脂肪酸组成和同位素特征的深入分析，还在于它为未来的研究提供了新的思路和技术手段。例如，CSIA技术可以用于追踪其他脂肪酸的代谢路径，甚至用于研究不同碳源对脂肪酸合成的影响。此外，研究结果还可以为其他微藻的同位素分析提供参考，帮助科学家更好地理解不同生物体在代谢过程中的碳分配机制。通过这些研究，可以进一步推动生物技术在食品、医药和环境治理等领域的应用。

综上所述，本研究不仅揭示了A. limacinum在不同生长阶段脂肪酸组成的显著变化，还通过CSIA方法分析了其碳同位素特征。这些发现对于理解脂肪酸的生物合成过程、优化其生产条件以及探索其在生物医学中的应用具有重要意义。同时，研究结果还表明，GC-C-IRMS技术在微藻系统中的应用能够有效支持对碳代谢路径的深入研究，为未来的代谢工程和生物技术发展提供重要的理论和技术基础。