磷肥形态显著塑造豌豆非根瘤内生菌的招募与多样性：基于长期施肥试验的微生物组学研究

本研究针对磷肥溶解度如何影响豌豆(Pisum sativum)非根瘤内生菌(NREs)的招募机制这一关键科学问题，通过9年长期田间试验比较了四种磷肥处理（无磷P0、骨炭BC、改性骨炭BCplus、三重过磷酸钙TSP）对土壤-根际-根-根瘤四重微环境中微生物群落的影响。采用16S rRNA扩增子测序技术揭示：1) 根瘤微生物主要来源于未知种源（可能为种子）和根系，BCplus处理促进有益菌Beijerinckiaceae和Flavobacteriaceae的招募；2) 高溶解度TSP处理增加根瘤微生物多样性但降低固氮基因nifH丰度；3) 无磷P0处理优先促进丛枝菌根真菌(AMF)定殖而非结瘤。该研究为优化磷肥选择以调控植物-微生物互作提供了重要理论依据。

　　

在可持续农业发展的背景下，如何通过优化施肥策略来促进作物与有益微生物的协同关系成为研究热点。豌豆(Pisum sativum)作为重要的豆科作物，其与根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv. viciae)的共生固氮系统已被广泛研究，但近年来发现根瘤中还存在着大量非根瘤内生菌(Non-rhizobial endophytes, NREs)。这些微生物虽然不直接参与固氮，却能通过解磷、产生植物激素或抑制病原体等方式增强植物健康。然而，农业管理措施特别是磷肥施用如何影响NREs的招募动态，以及磷肥溶解度是否会影响植物在丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)和根瘤菌之间的资源分配策略，这些问题尚未得到系统解答。

德国慕尼黑工业大学(Technische Universit?t München)环境微生物学团队在《Environmental Microbiome》发表的研究中，通过为期9年的长期田间试验，首次揭示了磷肥形态对豌豆根瘤微生物组装配的深远影响。研究人员设计了四种磷肥处理：无磷对照(P0)、低溶解度骨炭(BC)、中等溶解度改性骨炭(BCplus)和高溶解度三重过磷酸钙(TSP)，采用16S rRNA基因扩增子测序技术分析了从大田土壤到根瘤的微生物群落传递规律，并结合qPCR定量了固氮基因nifH和AMF丰度变化。

关键技术方法包括：1) 在德国布伦瑞克建立的9年长期田间试验，采用随机区组设计；2) 分层采集土壤、根际、根和根瘤样本并进行表面灭菌处理；3) 使用515F/806R引物对V4区进行16S rRNA基因扩增子测序；4) 通过qPCR定量nifH基因和AMF生物量；5) 采用PERMANOVA和线性混合效应模型进行统计学分析。

整体群落对施肥的响应
非度量多维标度(NMDS)分析显示，样本类型（土壤/根际/根/根瘤）解释了42%的群落变异，而施肥处理仅贡献3%。分区分析发现施肥对根(R²=0.21)和根瘤(R²=0.14)微生物组成影响显著，但对土壤和根际无显著影响。这表明植物内部组织对磷肥变化更为敏感。

土壤与根际群落的稳定性
尽管磷肥处理显著提高了土壤有效磷(PCAL)含量（从P0到TSP递增），但土壤和根际的α多样性无显著差异。骨炭处理(BC)显著提高了碳磷比(C:P=0.69 vs TSP的0.48)，可能促进了Caulobacteraceae等具有营养循环功能的细菌富集。值得注意的是，高溶解度TSP处理引入了Morganellaceae等罕见菌群，这些通常与昆虫内共生相关的菌群在植物组织中的出现暗示了潜在的跨界互作。

根系内生菌的差异化选择
BCplus处理显著提高了根系微生物多样性，其特有的Sphingobacteriaceae和Weeksellaceae可能参与硫氧化过程，这与该肥料添加的硫改性特性相符。无磷P0处理则富集了具有胁迫抗性的Sphingomonadaceae和固氮相关Beijerinckiaceae，反映出植物在低磷条件下对微生物功能的特异性选择。

根瘤微生物组的装配规律
研究最关键的发现是揭示了根瘤微生物的三大来源：42-45%来自未知种源（可能为种子垂直传递），24-30%来自根系，仅13-17%来自根际。高溶解度TSP处理显著增加了根瘤数量（比P0多38%）和微生物多样性，但降低了Rhizobiaceae相对丰度和nifH基因拷贝数，暗示NREs可能部分替代了传统共生体的功能。相反，BCplus处理优先招募具有植物促生特性的Beijerinckiaceae和Flavobacteriaceae，同时维持较高的根瘤菌比例，显示出最佳的共生平衡。

磷有效性对共生策略的调控
无磷P0处理表现出最高的AMF定殖率，符合"磷稀缺促进菌根共生"的理论预期。而随着磷肥溶解度增加，植物逐渐将投资转向结瘤过程，但不同磷源对AMF的影响非线性——TSP处理的AMF丰度与P0相当，而BCplus最低，这可能与硫改性引发的微生物互作有关。

这项研究通过多组学方法揭示了磷肥形态通过改变土壤磷有效性梯度，进而调控植物微生物组装配的级联机制。其重要理论价值在于：1) 证实了种子可能是根瘤微生物的重要"种子库"，拓展了植物微生物组垂直传递的认识；2) 阐明了中等溶解度磷肥(BCplus)在维持有益微生物互作方面的优势，为生态施肥提供了科学依据；3) 揭示了高磷条件下植物通过增加NREs多样性来优化共生效率的新策略。实践意义上，研究建议在豌豆种植中避免单一使用高溶解度磷肥，而应采用缓释型磷源配合硫元素添加，以促进有益微生物群落构建和系统稳定性。这些发现也为其他豆科作物的微生物组管理提供了范式参考。