单剂量mRNA疫苗编码猪瘟病毒E2-ECD蛋白在兔模型中诱导持久保护性免疫

本研究针对猪瘟病毒(CSFV)现有疫苗存在的安全性问题及无法区分感染与免疫动物(DIVA)的缺陷，开发了两种基于E2糖蛋白的mRNA疫苗。研究人员通过脂质纳米颗粒(LNP)递送系统，成功构建了编码E2胞外域(E2-ECD)及其N端片段(E2-ECD-N)的mRNA疫苗，在鼠和兔模型中证实单次接种即可诱导持久抗体反应和细胞免疫应答，为开发新型DIVA兼容疫苗提供了重要策略。该成果发表于《Veterinary Research》，为猪瘟防控提供了创新解决方案。

　　

猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的严重传染病，给全球养猪业造成巨大经济损失。虽然减毒活疫苗已广泛使用，但仍存在两大痛点：一是疫苗毒株可能返祖致病的潜在风险；二是无法区分自然感染与疫苗接种动物(Differentiation of Infected from Vaccinated Animals, DIVA)，这严重阻碍了疫病净化进程。E2糖蛋白作为CSFV主要保护性抗原，虽已有亚单位疫苗研发，但普遍存在免疫剂量高、需多次接种且细胞免疫诱导不足等问题。

武汉大学医学研究院和兰州兽医研究所的研究团队创新性地采用mRNA技术平台，设计开发了两种靶向E2糖蛋白的mRNA-LNP疫苗：一种编码E2胞外域全长(E2-ECD, aa1-337)，另一种编码其N端172个氨基酸片段(E2-ECD-N, aa1-172)。研究通过体外转录制备mRNA，采用微流控技术封装成脂质纳米颗粒，并在HEK293T细胞中验证了蛋白表达。免疫原性评估显示，两种疫苗在BALB/c小鼠中单次接种即可诱导高水平E2特异性抗体，且抗体滴度可持续至少6个月。值得注意的是，E2-ECD-N疫苗展现出更强的CD4⁺和CD8⁺T细胞激活能力，通过ELISpot和流式细胞术检测到显著的IFN-γ和IL-2分泌。

在关键的兔攻毒实验中，单剂100μg E2-ECD mRNA-LNP疫苗接种后31天，用100兔感染剂量(RID)的CSFV C株攻击，所有免疫兔均未出现发热症状，脾脏病毒RNA检测均为阴性，实现完全保护。更令人振奋的是，延长观察至18周（约4个月）后再次攻毒，保护效果依然稳固。通过检测Erns蛋白抗体证实了疫苗的DIVA特性，为疫情监测提供了重要工具。

该研究主要采用以下关键技术：1) 抗原设计中的哺乳动物密码子优化和信号肽添加；2) 脂质纳米颗粒(LNP)封装工艺；3) 小鼠和兔模型的免疫原性评价体系；4) 病毒中和试验和ELISpot检测细胞免疫；5) 兔模型攻毒保护实验。

【E2-ECD和E2-ECD-N mRNA疫苗的构建与表征】
研究人员巧妙设计三种mRNA构建体，包含Cap1结构、优化UTR和分泌信号肽。免疫印迹证实E2-ECD能形成天然二聚体结构，而E2-ECD-N为单体。LNP封装效率>90%，粒径约75nm，PDI<0.1，符合疫苗递送要求。

【小鼠模型中的免疫应答】
单剂5μg接种即可诱导持久抗体反应，加强免疫显著提升低剂量组效价。E2-ECD-N诱导更强的Th1型细胞免疫，CD8⁺T细胞中IFN-γ⁺比例达2.3%，显著高于对照组。

【兔模型中的保护效力】
E2-ECD组接种后28天抗体EC₅₀达10⁵，中和抗体滴度log₂5-10。攻毒后对照组全部发热≥40°C，而疫苗组体温正常，脾脏重量差异显著(p<0.01)。

【长期保护性评估】
18周后抗体仍维持较高水平，攻毒保护率100%。ELISpot显示早期(14天)可检测到IFN-γ⁺细胞，但120天时细胞应答减弱，提示抗体介导长效保护。

这项研究首次证实CSFV mRNA疫苗单剂接种即可提供长期保护，解决了传统疫苗的多剂次接种难题。特别重要的是，基于E2的疫苗设计实现了真正的DIVA功能，通过Erns抗体检测可区分自然感染。研究为猪瘟防控提供了创新解决方案，建立的mRNA疫苗平台技术也可拓展应用于其他动物疫病。未来需在猪体评估对强毒株的保护效果，并优化制剂以适应大规模免疫需求。该成果标志着动物疫苗进入mRNA技术新时代，对全球猪瘟净化计划具有重要推动作用。