N4BP1通过液-液相分离介导NEDD8修饰蛋白聚集体的形成及其在热休克应激中的细胞保护机制

本研究揭示了N4BP1作为核质穿梭蛋白的功能特性，发现其通过CoCUN结构域识别NEDD8修饰的蛋白（如cullin-1/2）形成液-液相分离（LLPS）聚集体，并在热休克应激中发挥关键保护作用，为理解蛋白质稳态调控和应激适应机制提供了新视角。

　　

论文解读

背景与科学问题
在细胞应对环境压力的过程中，蛋白质稳态（proteostasis）的维持至关重要。NEDD8（一种类泛素蛋白）修饰异常与神经退行性疾病、癌症等多种病理过程相关，但其在应激响应中的具体机制尚不明确。N4BP1（NEDD4-binding partner 1）作为NYN家族成员，虽已知参与炎症调控和病毒RNA降解，但其亚细胞定位、结构域功能及在蛋白质稳态中的作用长期存在争议。尤其令人困惑的是，既往研究对其核质分布报道不一，且其是否参与NEDD8相关应激响应仍属空白。

研究设计与结论
为解答这些问题，研究人员通过系统实验揭示了N4BP1的三大特性：

1. 核质穿梭机制：发现N4BP1通过279-299位点的核定位信号（NLS）实现核输入，且其核内分布以不溶性形式存在，经抑制剂leptomycin B处理后可显著积累（图1-3）。
2. 相分离聚集体形成：N4BP1在胞质和核内形成液-液相分离（LLPS）聚集体，可被1,6-己二醇（1,6-HD）溶解并动态重组，且与DNA空间分布互斥（图4）。
3. NEDD8特异性识别：聚集体富含NEDD8修饰的cullin-1/2，但无泛素化蛋白，依赖CoCUN结构域（P866位点）实现这一特异性（图5-6）。
4. 热休克保护功能：N4BP1缺失或MLN4924抑制NEDD8修饰均加剧热休克敏感性，而过表达N4BP1或增强聚集的NYN-CoCUN突变体显著提升细胞存活率（图7）。

技术方法
研究采用核质分离与不溶性组分提取、免疫荧光共定位、活细胞动态成像（Leica TCS SP8）、点突变构建（如P866A）及热休克模型（42°C水浴处理），结合抑制剂（MLN4924、1,6-HD）干预，系统解析N4BP1的功能机制。

关键结果

• 核穿梭与NLS鉴定：通过缺失突变和GFP融合实验，证实279-299aa的KRR/KK序列为功能性NLS（图3）。
• 相分离特性：N4BP1聚集体具有LLPS典型特征——动态融合、1,6-HD敏感性和快速恢复（图4D-E）。
• CoCUN域的核心作用：P866A突变破坏聚集体形成，而NYN-CoCUN片段（608-896aa）自主引发强聚集（图6）。
• 热休克保护：N4BP1依赖NEDD8聚集缓解热损伤，且其核内不溶性组分在应激后显著增加（图7F-G）。

意义与展望
该研究首次阐明N4BP1通过CoCUN域选择性招募NEDD8修饰蛋白形成保护性聚集体，为理解类泛素系统在应激响应中的非经典功能提供了范式。其发现的核质穿梭机制和相分离特性，不仅解决了既往关于N4BP1定位的争议，还为开发靶向蛋白质聚集的神经退行性疾病干预策略提供了新靶点。未来需进一步探究N4BP1聚集体在病理条件下的动态调控及其与其他应激通路（如热休克蛋白HSP）的交互作用。