基于蛋白序列信息的线性与环状肽结合剂智能设计方法EvoBind2

本研究针对蛋白质相互作用设计中的关键挑战，开发了仅需靶蛋白序列即可设计新型肽结合剂的EvoBind2方法。通过结合AlphaFold2和AlphaFold-Multimer的对抗性验证，成功设计了亲和力达7.5 nM的线性肽和6.5 μM的环状肽，解决了传统方法依赖结构信息、无法设计短肽的难题，为靶向治疗提供了全新工具。

　　

在蛋白质设计的黄金时代，AlphaFold等结构预测技术虽已实现单链蛋白的高精度设计，但功能性设计尤其是蛋白质相互作用领域仍存在重大挑战。短肽因其合成成本低、空间位阻小、环化后细胞穿透性强等优势，成为理想的靶向分子，然而其结构灵活性和有限的实验数据使得理性设计异常困难。传统方法需要预先知道靶蛋白结构、结合位点或结合剂尺寸，这严重限制了新型靶点的开发。

针对这一瓶颈，斯德哥尔摩大学（Stockholm University）的Patrick Bryant团队开发了革命性的EvoBind2算法。这项发表在《Communications Chemistry》的研究，仅需靶蛋白氨基酸序列即可自主设计8-20个残基的线性/环状肽结合剂，无需任何先验结构信息。通过将定向进化与对抗性验证相结合，成功突破了短肽设计的三大障碍：结合位点未知、结合剂长度不定和假阳性预测。

研究采用多技术联用策略：1）基于AlphaFold2的迭代序列-结构联合优化；2）引入AlphaFold-Multimer（AFM）进行对抗性验证；3）表面等离子共振（SPR）定量检测结合亲和力；4）环状肽设计采用相对位置编码技术。以半合成核糖核酸酶（PDB ID 1SSC）为模型靶点，所有设计均通过溶解度过滤（>25%带电残基，<25%疏水残基）。

线性与环状肽结合剂设计
EvoBind2通过最小化界面距离（interface distances）和最大化肽段plDDT（predicted local distance difference test）的损失函数（Loss 1），实现了完全自由的序列-结构联合优化。对13种长度的线性肽设计显示，38%（5/13）达到μM级亲和力，最优设计K_d达7.5 nM，较阳性对照（1.2 μM）提高162倍。环状肽设计同样突破传统限制，10残基环肽获得6.5 μM亲和力，接触残基与天然结合剂仅32%重合，证实了算法创造新颖结合模式的能力。

对抗性设计验证
针对AlphaFold2可能产生的假阳性（高plDDT但实际不结合），研究创新性地采用AFM进行正交验证（Loss 2）。当两种独立训练的神经网络预测一致时（双低损失），结合成功率提升2.5倍（5/13 vs 2/13）。AFM损失与K_d的Spearman相关性达0.96，成为最可靠的虚拟筛选指标。

亲和力与虚拟指标关联
分析显示：肽段长度与亲和力弱相关，关键结合残基起主导作用；AFM的plDDT与亲和力呈正相关（R=-0.54），而EvoBind2的plDDT呈负相关（R=0.79）。值得注意的是，所有虚拟指标均无法完全区分真假结合剂，凸显了实验验证的必要性。

优化影响因素
线性肽的损失随长度增加（R=0.857），而环状肽无此趋势（R=0.093），表明环化可克服长肽构象限制。五次独立重复实验证实，不同初始序列均可收敛到相近损失值，证明算法的鲁棒性。

这项研究开创了"序列→功能"的短肽设计新范式，其核心突破在于：1）首次实现完全盲设计的肽结合剂开发；2）通过对抗性验证将假阳性率降低60%；3）同步解决线性/环状肽设计难题。EvoBind2已开源（GitHub/Colab），为靶向降解、受体调控等生物医学应用提供了高效工具。未来需在更多靶点上验证普适性，但现有成果已为"无结构信息"的药物设计开辟了新道路。