基于胶原结合特性的牛奶细胞外囊泡亚群分离及其在骨再生中的功能差异研究

推荐：研究人员针对骨缺损修复中细胞外囊泡(EVs)功能异质性问题，通过分离牛奶来源EVs(mEVs)的胶原结合亚群(cb+mEVs)，发现其通过富集膜联蛋白V(AnxV)显著促进hBMSCs成骨分化(钙沉积增加1.2倍)和骨质疏松大鼠骨缺损修复(骨形成提高2.4倍)，为功能性EV亚群筛选提供了新策略。

　　

骨质疏松性骨折伴随的骨缺损修复是临床重大挑战，传统自体骨移植存在供体受限等问题。细胞外囊泡(EVs)作为新兴治疗工具，其异质性严重制约临床转化——不同亚群可能具有完全相反的功能特性。来自深圳大学的研究团队创新性地利用I型胶原结合特性，从牛奶EVs(mEVs)中分离出功能性亚群，为骨再生医学提供了标准化EV治疗方案，相关成果发表于《Materials Today Bio》。

研究采用超速离心结合尺寸排阻色谱(SEC)纯化mEVs，通过胶原结合实验分离亚群，结合蛋白质组学、免疫磁珠分选和3D水凝胶构建等技术。骨质疏松大鼠股骨髁缺损模型验证治疗效果，显微CT和组织学分析评估骨再生。

3.1 mEVs的分离与表征
通过冷冻电镜确认mEVs为直径<200 nm的双层膜结构，蛋白质含量0.5 fg/颗粒，表达CD9/CD81等标志物，符合国际细胞外囊泡学会(ISCT)标准。

3.2 mEVs促进成骨
体外实验显示mEVs使hBMSCs的I型胶原表达增加，碱性磷酸酶(ALP)活性和钙沉积显著提升。人骨器官培养模型中，局部注射mEVs使缺损边缘荧光标记的钙沉积增加。

3.3 胶原结合亚群的功能优势
仅4%的mEVs具有胶原结合能力(^cb+mEVs)。该亚群被hBMSCs高效内吞(>60%)，使钙沉积量达106.9 μg/ml，显著高于非结合亚群(^cb-mEVs)的90.8 μg/ml。

3.4 AnxV的关键作用
蛋白质组学发现^cb+mEVs富集AnxV(膜联蛋白V)，其与CD9形成复合物。免疫磁珠去除AnxV阳性mEVs后，hBMSCs对EVs的摄取和成骨分化能力显著降低。

3.5 3D水凝胶递送系统
胶原水凝胶可缓释mEVs(14天释放85%)，封装^cb+mEVs的水凝胶使hBMSCs钙沉积量最高，证实该亚群在立体培养中的优势。

3.6 体内骨再生验证
在骨质疏松大鼠模型中，含完整mEVs的水凝胶使骨体积分数(BV/TV)提升2.4倍，而去除^cb+mEVs或AnxV阳性亚群后疗效消失。EVG染色显示仅完整mEVs组有新生的致密胶原纤维。

该研究首次证实EVs的胶原结合能力可作为功能性亚群分离标准，揭示AnxV是介导mEVs骨再生功能的关键表面蛋白。相比传统EV异质性研究多聚焦大小差异，该团队开创性利用ECM互作特性，为开发"即用型"骨修复材料奠定基础。通过建立"EV固有特征-分子机制-功能输出"的完整证据链，不仅解决了牛奶EVs临床应用的核心瓶颈，更为其他组织来源EVs的精准分选提供了范式。未来通过扩大AnxV阳性亚群富集规模，有望实现骨质疏松性骨缺损的标准化EV治疗。