跨界保守机制：细菌防御素Actifensin与真核防御素在抗菌治疗中的协同进化与创新应用

本研究针对抗生素耐药危机，揭示了放线菌源抗菌肽Actifensin通过结合细胞壁前体脂质II（lipid II）抑制肽聚糖合成的独特机制。研究人员通过结构功能分析、生物物理互作验证及细胞模型，证实该肽具有广谱抗革兰氏阳性菌活性（尤其对VRE/VISA）、无溶血毒性（>128μg/mL）且不诱发免疫反应，其GXGCP结构基序的跨物种保守性为新型抗菌药物设计提供了进化模板。该成果发表于《npj Antimicrobials and Resistance》，为开发基于古老防御素结构的下一代抗生素奠定基础。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的背景下，寻找新型抗菌药物成为全球紧迫课题。传统抗生素开发陷入瓶颈，而天然抗菌肽因其独特作用机制和低耐药性特点重获关注。其中，防御素（defensin）作为广泛存在于真核生物中的抗菌肽家族，通过靶向细菌细胞壁前体脂质II（lipid II）发挥杀菌作用，但原核生物中类似分子的发现与机制研究仍属空白。

爱尔兰科克大学（University College Cork）APC微生物组研究所的研究团队在《npj Antimicrobials and Resistance》发表突破性研究，首次从放线菌（Actinomyces ruminicola DPC7226）中鉴定出具有真核防御素结构特征的细菌素Actifensin，并系统解析其作用机制与治疗潜力。这项研究不仅填补了原核-真核防御素进化研究的空白，更为开发抗耐药菌新药提供了分子蓝图。

研究采用异源表达纯化、生物物理互作检测和细胞功能分析等技术体系。通过毕赤酵母系统生产重组Actifensin，结合薄层色谱（TLC）和等温滴定量热法（ITC）验证其与脂质前体的结合特性；利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）应激报告系统、膜电位探针（DiSC₃(5)）和人工脂质体等模型评估膜破坏效应；采用人红细胞溶血实验、肝细胞（Hep G2）活力检测及外周血单核细胞（PBMCs）免疫反应分析评价安全性。

Actifensin直接结合肽聚糖前体分子lipid II
通过枯草芽孢杆菌ypuA启动子特异性激活实验，发现Actifensin专一性干扰细胞壁合成通路。ITC测定显示其以纳摩尔级亲和力结合lipid I（K_d=24±27 nM）和lipid II（K_d=30±20 nM），且不依赖lipid II的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）结构域。这种广谱结合特性使其对万古霉素耐药菌株（如携带D-Ala-D-Lac修饰的VRE）仍保持高效抑制。

Actifensin通过细胞壁弱化间接导致细菌死亡
相位差显微镜观察到Actifensin处理后的细菌出现典型膜泡结构，但DiSC₃(5)荧光检测和人工脂质体实验均未检测到直接膜破坏。MinD蛋白极性定位实验显示膜电位扰动延迟出现（30分钟后），表明细胞死亡源于肽聚糖合成受阻导致的渗透压失衡，而非直接膜穿孔作用。

低毒性及免疫惰性特征
在128μg/mL浓度下，Actifensin未表现溶血活性或肝细胞毒性。与人类抗菌肽LL-37不同，其不调节TLR4/TLR2通路（如LPS或Pam3CSK4诱导的TNF分泌），对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞壁成分（如磷壁酸）触发的免疫反应也无影响，提示临床应用时可能避免不必要的炎症反应。

GXGCP亚家族的结构进化保守性
序列分析揭示Actifensin属于GXGCP结构亚家族（含N端Gly-Phe-Gly-Cys-Pro基序），该家族横跨细菌、真菌和原始无脊椎动物。与节肢动物特有的XTCD亚家族相比，GXGCP成员保守保留plectasin中脂质II结合关键残基（如F2、H18、Y40），暗示三硫键稳定CSαβ（3-disulfide cystine-stabilized αβ）结构的跨物种功能保守性。

这项研究首次证实原核与真核防御素在脂质II靶向机制上的深度进化保守性，为理解抗菌肽的起源提供新视角。Actifensin对耐药菌株（如VRE）的强效抑制、对哺乳动物细胞的安全性以及结构可塑性（52%-100%序列变异的47个同源物），使其成为抗耐药菌药物开发的理想模板。研究者特别指出，放线菌门中防御素样基因簇的广泛存在，暗示微生物可能通过水平基因转移获得这类古老武器，这一发现将推动从环境微生物中挖掘新型抗菌分子。