SPIDR技术：高通量单核苷酸分辨率解析RNA-蛋白互作网络揭示LARP1-mTOR调控翻译抑制新机制

本研究针对RNA结合蛋白(RBP)靶标鉴定通量低、分辨率不足的难题，开发了SPIDR（分裂-池化鉴定技术），首次实现单次实验同时绘制数十种RBP的单核苷酸精度结合图谱。通过该技术发现LARP1与18S rRNA在40S核糖体mRNA入口通道的精确互作，结合冷冻电镜解析2.8?结构，阐明mTOR抑制时4EBP1选择性结合TOP mRNA的翻译抑制机制，为RNA调控网络研究和疾病靶点发现提供了突破性工具。

　　

在生命活动的精密调控网络中，RNA结合蛋白(RBP)如同分子指挥家，掌控着mRNA从转录到降解的全生命周期。人类基因组中约30%的蛋白质可能具有RNA结合能力，其突变与神经退行性疾病、癌症等密切相关。然而传统CLIP技术每次仅能分析单个RBP，绘制K562细胞中62个RBP图谱就耗费了ENCODE计划大量资源。这种"盲人摸象"式的研究模式严重制约了对RNA调控网络的系统性认知，尤其难以捕捉细胞应激等动态过程中RBP的协同作用机制。

哥伦比亚大学和加州理工学院的研究团队突破技术瓶颈，开发出SPIDR（分裂-池化鉴定技术）。这项革新性方法通过抗体-磁珠复合物库和组合条形码策略，将RBP-RNA互作研究的通量提升两个数量级。研究首次实现单次实验同时解析62个RBP的单核苷酸精度结合图谱，覆盖剪接调控（如PTBP1）、翻译起始（如eIF3B）、非编码RNA调控（如LARP7）等各类功能蛋白。

关键技术包括：1）抗体-磁珠复合物库构建，实现数十种RBP的同步免疫沉淀；2）分裂-池化条形码策略，通过6轮36种条形码的组合标记实现单磁珠分辨率；3）紫外交联结合cDNA转换，保留单核苷酸精度结合信息；4）冷冻电镜技术解析关键复合物结构。

研究取得系列重要发现：
SPIDR精准绘制经典RNP互作图谱
技术验证阶段，SPIDR准确捕获LSM11-U7 snRNA、LIN28B-let-7 miRNA等已知互作，并发现23种RBP存在自我mRNA结合的自调控现象。与ENCODE eCLIP数据对比显示，HNRNPK、PTBP1等蛋白的结合位点高度一致（Pearson R=0.84-0.92）。

揭示核糖体结合蛋白的新互作模式
在18S rRNA上精确定位RPS2、RPS6等核糖体蛋白的结合位点，发现eIF3B除已知mRNA入口位点外，还在rRNA螺旋44存在新结合位点，提示其调控起始密码子选择的保守机制。

LARP1-40S复合物结构解析
冷冻电镜（2.8?）显示LARP1的核糖体结合域(RBR)占据40S亚基mRNA通道，与解码中心碱基C¹⁶⁹⁸/C¹⁷⁰¹相互作用，结构分析表明该结合会与A/P位点tRNA产生空间冲突。这为LARP1既促进又抑制TOP mRNA翻译的矛盾报道提供了结构解释：正常状态下TOP基序可驱逐LARP1促进翻译，而应激状态下LARP1滞留导致抑制。

mTOR抑制下的选择性翻译抑制机制
Torin1处理实验发现，mTOR失活时4EBP1与TOP mRNA结合增加20倍，且与LARP1靶mRNA存在15.8倍共富集。这表明4EBP1通过结合LARP1预装的TOP mRNA，阻断eIF4E-eIF4G复合物形成，实现靶向性翻译抑制，解释了mTOR抑制剂选择性调控的分子基础。

这项研究开创了RNA-蛋白互作研究的新范式。SPIDR技术使单个实验室就能完成以往需要国际协作的RBP图谱绘制，对罕见细胞样本和临床标本研究尤为重要。发现LARP1-40S的精确互作不仅解决了翻译调控领域的长期争议，还为病毒感染（如SARS-CoV-2 NSP1类似机制）、癌症（mTOR通路异常）等疾病的治疗靶点发现提供了新视角。研究建立的冷冻电镜结构数据库和SPIDR技术平台，将持续推动RNA生物学和精准医学的发展。