完整感染细胞中结构宿主-病毒互作组的高分辨率解析：基于交联质谱与AlphaFold建模的HSV-1互作网络研究

这篇研究开创性地结合细胞内交联质谱（XL-MS）与生物正交标记技术，开发了结构宿主病毒互作组分析（SHVIP）方法，首次在完整HSV-1感染细胞中系统绘制了739个蛋白质相互作用（PPIs），其中441个涉及病毒蛋白。通过整合AlphaFold多聚体预测，揭示了病毒糖蛋白与内质网伴侣、UL47-DDB1复合物等关键互作界面的结构基础，并鉴定了UL12无序区竞争性结合MAPK8和14-3-3蛋白的线性基序（SLiMs），为疱疹病毒侵染机制和抗病毒靶点发现提供了全新视角。

　　

完整感染细胞中HSV-1结构互作组的系统性解析

技术突破：SHVIP方法的建立
研究团队开发了结构宿主病毒互作组分析（SHVIP）技术，通过将膜渗透性交联剂DSSO与L-高炔丙基甘氨酸（HPG）代谢标记相结合，在保持细胞完整性的前提下选择性富集新合成的病毒蛋白及其互作网络。该方法使病毒蛋白在质谱检测中的贡献从20%提升至75%，显著提高了低丰度病毒互作蛋白的检出率。通过两种质谱采集方案（MS2-MS3和MS2-only）的互补验证，最终在人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）的HSV-1感染模型中鉴定出6,194个交联肽段，构建了包含739个蛋白质相互作用（PPIs）的网络，其中441个直接涉及病毒蛋白，覆盖了68%的病毒编码蛋白。

空间互作图谱的精细绘制
基于网络中心性分析，病毒-宿主互作被划分为6个功能群落：

1. 核糖体相关群（群落4/5）：包含UL49与核糖体蛋白的互作，印证了该病毒蛋白调控翻译的功能
2. 染色质调控群（群落6）：UL49与组蛋白的密集交联揭示了其通过液-液相分离（LLPS）调控染色质的机制
3. 内质网-高尔基体群（群落1/3）：病毒糖蛋白gB/gH-gL与内质网伴侣（PDIA4/6）和整合素（ITGA5/ITGB1）的互作，证实了病毒包膜蛋白成熟与细胞进入途径的关联

特别值得注意的是，99.6%的跨膜蛋白交联严格遵循区室化规律——病毒糖蛋白的腔外结构域仅与胞质蛋白（如Rab GTPases）交联，而腔内结构域则特异性结合ER驻留蛋白（如STT3A寡糖转移酶），这一发现证实了SHVIP能精准保留细胞内膜系统的完整性。

与传统方法的互补性验证
通过对比八种病毒蛋白（UL12/UL47/UL49等）的SHVIP与亲和纯化质谱（AP-MS）数据，发现：

• 42个互作在两种方法中均被检出（如UL47-UL48）
• 核小体相关蛋白等19个互作仅在SHVIP中捕获，提示这些依赖完整染色质环境的相互作用在细胞裂解时被破坏
• UL49与组蛋白的互作在AP-MS中完全缺失，印证了该蛋白通过LLPS组织染色质的特性

AlphaFold辅助的结构预测突破
研究团队利用AlphaFold-Multimer预测了所有病毒-宿主二聚体结构，并根据交联距离约束筛选出30个高置信度模型（ipTM>0.75）：

1. UL47-DDB1复合物：预测发现UL47 C端螺旋（676-693aa）以类似DCAF受体的方式结合CRL4泛素连接酶，突变实验证实该区域缺失会使DDB1结合完全丧失
2. US12-PPIA复合物：首次揭示免疫逃逸蛋白US12与肽酰脯氨酰异构酶的相互作用界面
3. UL12-MAPK8复合物：无序区（35-50aa）形成D-基序（P39/L44）结合MAPK8对接槽，而相邻的S41则构成14-3-3结合位点，双突变实验显示这两个基序存在竞争性结合

在低置信度预测中（0.5<>

无序区线性基序的发现
通过开发新型算法，团队从AF预测模型中筛选出16个位于固有无序区（IDRs）的潜在短线性基序（SLiMs）：

1. UL49-PPP1CA互作：鉴定出非经典RVXF基序（R52/F57），突变后磷酸酶结合显著减弱
2. gE-AP1M1互作：预测出酪氨酸分选基序，可能调控病毒包膜蛋白的运输
3. UL49-MAP1LC3B互作：发现新型LC3相互作用区（LIR），暗示病毒可能劫持自噬通路

这些发现突破了传统基序预测仅依赖序列相似性的局限，通过整合结构环境与共进化信息，为病毒-host界面研究提供了新范式。

方法论意义与转化前景
SHVIP技术的优势在于：

1. 适用于任何引发宿主关闭（host shutoff）的病毒，包括流感病毒、痘病毒等
2. 无需基因改造即可研究新兴病毒
3. 能捕获依赖相分离等细胞微环境的瞬时互作

该研究不仅为HSV-1的核衣壳组装、膜融合、免疫逃逸等过程提供了分子图谱，其建立的方法体系更为广谱抗病毒药物靶点发现开辟了新途径。例如，针对UL47-DDB1界面的抑制剂可能干扰病毒对宿主泛素化系统的操控，而UL12无序区双基序的发现则为开发竞争性抑制剂提供了精确靶标。