人源穹窿体复合物结构解析：PARP4与NAD+结合调控货物运输的分子机制

本研究针对真核生物中保守的巨型核糖核蛋白复合物——穹窿体（vault）的分子功能不明确问题，通过冷冻电镜技术解析了人源穹窿体与PARP4（poly(ADP-ribose) polymerase 4）及NAD+的三元复合物结构，首次揭示了PARP4通过MINT结构域与MVP（major vault protein）的静电互补界面结合，并发现MVP的SPFH结构域存在NAD+结合口袋。研究结合蛋白质组学证实PARP4通过调控穹窿体互作蛋白网络影响其亚细胞定位与货物选择，为理解穹窿体在肿瘤耐药、代谢调控等病理过程中的作用提供新视角。论文发表于《Nature Communications》。

　　

在真核细胞中存在一种神秘的巨型复合物——穹窿体（vault），其形似中世纪教堂的拱顶结构，由78个主要穹窿体蛋白（MVP）单体组装成椭圆形的纳米笼结构。尽管发现已逾三十年，这个"细胞中的诺亚方舟"如何选择运输的"货物"分子、如何响应外界信号等问题始终未解。尤其令人困惑的是，脊椎动物穹窿体中唯一具有酶活性的次要组分PARP4（多聚ADP核糖聚合酶4），如何与MVP结合并发挥功能一直是领域内的未解之谜。

芝加哥大学的研究团队通过冷冻电镜技术首次捕获了人源穹窿体与PARP4及辅酶NAD⁺的三元复合物结构，分辨率达到2.9?。研究发现PARP4通过其MINT结构域与MVP的3-5重复域形成静电互补界面，关键残基K1618（PARP4）与D214（MVP）的盐桥突变可破坏该相互作用。令人意外的是，在MVP的SPFH（Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflK）结构域中发现了一个全新的NAD⁺结合口袋，由相邻MVP单体的R511、H509等残基协同稳定NAD⁺的二磷酸基团。

研究采用昆虫细胞共表达系统获得完整穹窿体复合物，通过冷冻电镜单颗粒分析解析结构；利用等温滴定量热法验证NAD⁺结合特性；基于CRISPR/Cas9构建PARP4敲除细胞系，结合免疫共沉淀-质谱技术分析穹窿体互作蛋白组；通过分子对接模拟PARP4催化模块与MVP的空间排布。

结构解析揭示PARP4结合机制
冷冻电镜结构显示，PARP4的MINT结构域像"锚"一样固定在穹窿体腰部，其螺旋h4-h5与MVP3-5结构域形成电荷互补界面。关键残基突变实验证实，PARP4的S1614、K1618与MVP的R169、D214构成氢键网络，破坏这些相互作用会导致复合物解离。

NAD⁺结合口袋的意外发现
在MVP的SPFH结构域界面发现一个带正电的"锁孔"（keyhole loop），可特异性结合NAD⁺的腺嘌呤和核糖部分。相邻MVP单体的R507和K573中和二磷酸基团的负电荷，而H509与核糖羟基形成氢键。该位点也能结合ADP，提示其可能响应细胞能量状态变化。

PARP4调控穹窿体货物选择
蛋白质组学比较显示，野生型细胞中穹窿体更多结合膜相关蛋白（如SLC25A1线粒体NAD⁺转运体），而PARP4敲除后则富集核内基因调控蛋白（如锌指蛋白ZNF420）。约30%的野生型特异性互作蛋白是已知的ADP核糖化修饰靶标，暗示PARP4可能通过修饰作用调控货物装载。

这项研究首次在原子水平阐明了穹窿体的"分子身份证"PARP4如何与MVP结合，并意外发现MVP自身具有NAD⁺存储功能。这种"酶-底物共定位"的巧妙设计提示穹窿体可能是细胞内的"代谢反应器"，其通过PARP4的ADP核糖化修饰动态调控货物分子的装载与运输。研究成果不仅为理解穹窿体在肿瘤耐药（如MVP高表达导致化疗药物外排）和免疫应答（如病毒RNA运输）中的作用提供结构基础，也为基于穹窿体的药物递送系统设计提供了精准的分子改造靶点。