胶原葡萄糖基转移酶的结构基础及其意外发现的kojibiose合成功能

本研究解析了mimiviral胶原葡萄糖基转移酶(R699)的晶体结构，揭示其通过同源二聚化实现UDP-葡萄糖协同结合和催化活性的分子机制，意外发现该酶具有合成益生元二糖kojibiose的功能，为开发胶原糖基化相关疾病抑制剂和kojibiose生物合成提供了新思路。

　　

在生命体系中，胶原蛋白作为最丰富的蛋白质家族，其翻译后修饰对组织稳态和疾病发展具有关键调控作用。其中，赖氨酸残基的羟基化和糖基化修饰尤为特殊——这些修饰不仅影响胶原纤维的力学性能，更在血管发育、血小板聚集和癌症转移等生理病理过程中扮演重要角色。然而，负责胶原糖基化的葡萄糖基转移酶(GGT)如何识别底物、如何响应细胞内UDP-葡萄糖水平波动等核心问题，长期以来缺乏结构生物学证据。与此同时，在食品和医药领域具有重要应用价值的益生元二糖kojibiose，由于缺乏高效合成方法，其规模化生产一直面临挑战。

来自国外研究机构的研究人员通过X射线晶体学等方法，成功解析了mimiviral胶原葡萄糖基转移酶R699的系列高分辨率结构，包括apo状态、与UDP结合状态以及与二糖产物复合物状态。研究采用的主要技术包括：蛋白质结晶与结构解析（获得1.50-1.80 ?分辨率晶体结构）、微尺度热泳动法（测定UDP-葡萄糖结合亲和力与协同性）、SEC-DLS分析（表征蛋白质寡聚状态）、酶活检测（基于荧光素酶的UDP生成检测系统）以及GC-MS分析（验证kojibiose体内合成）。

研究结果部分的重要发现包括：

R699形成同源二聚体
通过晶体结构分析和SEC-DLS验证，发现R699通过F204、T243等关键残基的疏水相互作用形成稳定的反平行二聚体。二聚化界面形成的"锁-钥"结构（一个亚基的环状结构插入另一亚基的裂隙）对维持UDP-葡萄糖结合协同性和酶活性至关重要。破坏二聚化的F204R/T243R双突变使酶完全丧失活性。

UDP-葡萄糖结合的协同机制
结构比较揭示了"2K-1E三体"（K222、K438、E54）在UDP结合时的构象重排：apo状态下K222与E54可能形成瞬态盐桥，UDP结合后K222转向与UDP磷酸基团作用，同时E54与AC域的K438形成稳定盐桥。这种变构调节解释了PLOD2b特有的UDP-葡萄糖高亲和力协同结合现象。

延伸裂隙的胶原识别机制
二聚体形成的U型表面裂隙（直径7-11?）两侧各有一个活性中心，中心位点N193的突变（N193R）显著降低对胶原底物的活性，但不影响对游离半乳糖基羟基赖氨酸的活性，证实该裂隙参与胶原识别。

意外的kojibiose合成活性
在试图解析酶-底物复合物结构时，意外发现R699能以UDP-葡萄糖为供体、游离葡萄糖为受体，合成α(1→2)连接的kojibiose。结构显示产物通过W118、D162、D163等残基构成的延伸口袋稳定结合，E114和N218对催化至关重要。在hexokinase缺陷型大肠杆菌MEC143中成功实现kojibiose的体内合成，产量达麦芽糖的15%。

这项研究首次揭示了胶原葡萄糖基转移酶通过二聚化实现底物协同识别的结构基础，阐明了"2K-1E三体"变构调节的分子机制，为开发靶向不同PLOD亚型的特异性抑制剂提供了理论依据。意外发现的kojibiose合成活性不仅拓展了对病毒糖基转移酶功能多样性的认知，更为这种具有益生作用的稀有糖工业化生产提供了新策略。该成果对理解胶原修饰在发育和疾病中的作用，以及开发新型生物制造工艺都具有重要意义。