铜死亡诱导联合CAR-T细胞疗法：重塑骨肉瘤免疫抑制微环境的新策略

针对骨肉瘤(OS)中CAR-T细胞疗法受免疫抑制性肿瘤微环境(TME)限制的难题，南方医科大学团队开发了搭载铜离子载体(ESCu)和PD-L1抗体的DNA四面体框架核酸(tFNAs)纳米药物。该研究首次揭示铜死亡(cuproptosis)可下调OS细胞PD-L1表达，并通过协同诱导铜死亡和阻断PD-1/PD-L1通路，显著增强CAR-T细胞的肿瘤浸润和杀伤能力，为实体瘤免疫治疗提供新思路。

　　

骨肉瘤作为最具威胁性的恶性骨肿瘤，即便经过手术和化疗，患者5年生存率仍停滞在60%左右。传统治疗面临耐药性和转移复发的严峻挑战，而新兴的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法在实体瘤中又遭遇免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的阻碍。特别是当GD2特异性CAR-T细胞与骨肉瘤细胞相互作用时，会触发肿瘤细胞高表达PD-L1，进而导致CAR-T细胞凋亡和功能耗竭。这一"双刃剑"效应使得CAR-T细胞在骨肉瘤治疗中举步维艰。

南方医科大学的研究团队另辟蹊径，从铜代谢这一全新角度切入。铜作为线粒体细胞色素氧化酶C的关键辅因子，在肿瘤细胞能量供应中扮演重要角色。最新研究发现，过量铜离子可通过靶向三羧酸(TCA)循环中的硫辛酰化蛋白，诱导线粒体功能紊乱，引发一种新型程序性细胞死亡——铜死亡(cuproptosis)。有趣的是，铜死亡在不同肿瘤中对PD-L1表达的影响存在差异：在膀胱癌中促进PD-L1表达，而在结直肠癌中却降低其表达。这种组织特异性效应为骨肉瘤的联合治疗提供了潜在靶点。

研究人员首先通过生物信息学分析88例儿童骨肉瘤患者的基因组数据，发现铜死亡相关基因(CRGs)与CD274(PD-L1基因)表达呈正相关。实验证实铜死亡可下调人骨肉瘤细胞中PD-L1表达，这一发现与结直肠癌研究结果一致。基于此，团队创新性地设计了一种多功能纳米药物tFNAs@ESCu/aPD-L1：以具有优异细胞膜穿透能力的四面体框架核酸(tFNAs)为载体，内部封装铜离子载体ESCu，表面通过二硫键偶联PD-L1抗体(aPD-L1)。这种设计巧妙利用了肿瘤微环境的高谷胱甘肽(GSH)特性实现药物响应性释放。

研究采用的主要技术包括：生物信息学分析TARGET数据库的骨肉瘤患者RNA-seq数据；构建携带GD2特异性CAR(含41BB和CD3ζ信号域)的慢病毒载体；通过原子力显微镜(AFM)和透射电镜(TEM)表征纳米药物形貌；建立原位和再挑战骨肉瘤小鼠模型评估疗效；以及转录组测序分析铜死亡对骨肉瘤细胞信号通路的影响。

铜死亡减少OS细胞PD-L1表达
通过分析临床样本和体外实验，研究人员发现铜死亡相关基因(DLAT、DLD、PDHB、GLS等)与CD274表达呈正相关。使用1200 nM ESCu诱导铜死亡12小时后，143B骨肉瘤细胞中CRGs和CD274的mRNA表达均下调。Western blot显示铜死亡相关蛋白(FDX1、LIAS)和PD-L1表达降低，而DLAT蛋白因寡聚化作用表达升高。这些结果证实铜死亡可重塑骨肉瘤免疫微环境。

纳米药物设计与表征
tFNAs@ESCu/aPD-L1纳米药物直径约20nm，ESCu封装效率达85.34%，aPD-L1偶联效率达92.96%。在模拟肿瘤微环境的酸性(pH6.5)和高GSH(10mM)条件下，药物释放速率显著加快。这种特性使其在正常组织中保持稳定，而在肿瘤部位高效释放。

纳米药物选择性杀伤OS细胞
纳米药物对骨肉瘤细胞(143B、U2OS、SJSA1)的半数抑制浓度(IC₅₀)显著低于对CAR-T细胞的毒性浓度。三维肿瘤球实验显示，tFNAs@ESCu/aPD-L1处理组死亡细胞比例最高。透射电镜观察到线粒体肿胀、膜结构破坏等铜死亡特征性改变。划痕实验和Transwell实验证实纳米药物可抑制肿瘤细胞迁移侵袭。

调控转录组增强免疫应答
转录组分析揭示，tFNAs@ESCu/aPD-L1处理后的骨肉瘤细胞中，干扰素调节因子3(IRF3)介导的I型干扰素通路、STING通路和IL-12通路被激活。基因集富集分析(GSEA)显示TCA循环、PI3K-FGFR1信号通路被抑制，而MHC-II抗原呈递通路增强。这些变化有助于招募CD8⁺ T细胞并增强抗肿瘤免疫。

提升CAR-T细胞疗效
在共培养系统中，tFNAs@ESCu/aPD-L1使CAR-T细胞对143B细胞的杀伤率提升至75%，并显著降低耗竭标志物LAG-3和KLRG1表达。原位骨肉瘤模型显示，联合治疗组肿瘤生物发光信号降低最显著，CD8⁺ T细胞浸润比例达43.7%，PD-L1表达最低。再挑战实验证实该疗法可诱导免疫记忆形成，脾脏中记忆T细胞(T_m)比例达24.15%。

这项研究开创性地将铜死亡诱导与CAR-T细胞疗法相结合，通过多功能纳米药物同时实现代谢重编程和免疫检查点阻断。其重要意义在于：首次阐明铜死亡在骨肉瘤中对PD-L1的调控作用；开发出能响应肿瘤微环境的智能递药系统；为克服实体瘤CAR-T治疗障碍提供了"代谢-免疫"双靶向新策略。该成果不仅为骨肉瘤治疗带来突破，其设计思路也可拓展至其他高表达GD2的实体瘤，如神经母细胞瘤和黑色素瘤等，具有广阔的临床转化前景。