多重交叉置换扩增技术（MCDA）快速检测产毒艰难梭菌：一种潜力巨大的床旁检测方法

这篇研究开发了一种基于多重交叉置换扩增（MCDA）技术的快速检测方法，用于产毒艰难梭菌（toxigenic Clostridioides difficile）的床旁诊断。研究显示，MCDA具有与实时荧光定量PCR（real-time PCR）相当的灵敏度（93.1% vs 86.2%），但检测时间显著缩短（16.08±4.62分钟 vs 39.82±4.44分钟），且特异性（92.4%）和阴性预测值（NPV 98.8%）优于VIDAS毒素检测（CDAB）。该技术为资源有限地区的艰难梭菌感染（CDI）早期干预提供了高效解决方案。

　　

ABSTRACT

产毒艰难梭菌（toxigenic Clostridioides difficile）是引发艰难梭菌感染（CDI）的主要病原体，其快速检测对临床早期干预至关重要。本研究开发了一种靶向tcdB基因的多重交叉置换扩增（MCDA）技术，通过与实时荧光定量PCR和VIDAS毒素检测（CDAB）对比，证实MCDA的检测限（LoD）低至12.5 fg/反应（相当于2.5个基因组拷贝），且无交叉反应。在201例临床粪便样本中，MCDA检出40例阳性，平均检测时间（16.08±4.62分钟）显著短于PCR（39.82±4.44分钟），同时展现出更高的特异性（92.4% vs 80.8%）和阳性预测值（PPV 67.5% vs 43.2%）。

IMPORTANCE

MCDA技术的快速性（最快5.7分钟检出高浓度样本）、操作简便性及平衡的性能指标，使其特别适合资源有限地区的床旁检测（POCT）需求，甚至可用于潜在的自检场景。

INTRODUCTION

艰难梭菌感染（CDI）是全球抗生素相关性腹泻的主要病因，其临床谱从无症状携带到致命性伪膜性肠炎不等。尽管医院获得性CDI病例减少，社区获得性感染（CA-CDI）比例上升，美国2017年约22.4万例感染中半数源于社区。现有诊断方法如细胞毒性中和试验（CCNA）和酶免疫分析（EIA）存在耗时长（CCNA需48小时）或灵敏度低（EIA仅60-85%）的缺陷。尽管实时荧光定量PCR灵敏度高，但依赖专业设备和人员，限制了其在床旁的应用。

MATERIALS AND METHODS

研究团队针对tcdB基因（GenBank: KC292162.1）设计了4组MCDA引物，最终优选第2组（含10条引物），在63°C下实现高效扩增。临床样本来自2021年10月浙江省人民医院的腹泻患者粪便，通过Xpert C. difficile检测初筛后，采用MCDA、实时PCR、VIDAS CDAB和CCNA平行检测。

RESULTS

引物优化与特异性
引物组2在63°C下表现最佳，仅对6株产毒菌株（含ATCC BAA-1870）产生特异性扩增，非产毒菌株和27种腹泻相关病原体均为阴性。

灵敏度与速度
MCDA与实时PCR的LoD均为12.5 fg，但MCDA检测500 pg样本仅需5.7±0.5分钟，而实时PCR需23.97±0.3分钟；低浓度（12.5 fg）检测时间分别为21.35±2.2分钟和46.6±0.95分钟。

临床性能
以CCNA为金标准，MCDA的灵敏度（93.1%）显著高于VIDAS CDAB（34.5%），且阴性预测值（98.8%）优于VIDAS CDAB（90.1%）。尽管VIDAS CDAB特异性达100%，但其低灵敏度（34.5%）限制了临床应用。

DISCUSSION

MCDA通过10条引物靶向tcdB基因多个区域，其特异性优于传统PCR（仅用2引物1探针）。研究还发现，部分CCNA阴性样本被MCDA/PCR检出，可能因CCNA灵敏度不足导致假阴性。粪便中抑制剂（如胆汁酸）可能影响MCDA效率，未来需优化核酸提取流程。

该技术的单次检测成本约1.2美元，低于实时PCR（2.2美元），结合其便携性，尤其适合基层医疗机构。尽管MCDA无法区分CDI与无症状定植（CDC），但其高阴性预测值可有效排除非产毒菌株，减少不必要的抗生素治疗。

未来需开发集成横向流动试纸条的便携设备，并扩大临床验证以评估其在流行病学监测中的价值。