基于V3–V4和FL-16S rRNA扩增子测序的气管切开吸引物微生物群落分析方法评估及其在慢性危重症患者中的临床应用价值

这篇研究通过对比牛津纳米孔技术(ONT)的FL-16S rRNA长读长测序与Illumina V3–V4短读长测序，验证了前者在气管切开吸引物微生物群落分析中的优越性。研究采用MagMax DNA提取试剂盒和Emu生物信息学流程，证明FL-16S测序能提供物种级分辨率，尤其适用于低多样性的呼吸道样本，为慢性危重症患者的呼吸道感染病原体鉴定和微生物生态研究提供了新方法。

　　

ABSTRACT
呼吸道感染对需要长期机械通气的患者构成重大风险，但关于慢性危重症患者气管切开期间复杂微生物组动态的信息有限。牛津纳米孔技术(ONT)的长读长测序可实现全长16S rRNA(FL-16S)扩增子测序，提供呼吸道微生物组的物种级解析。本研究通过比较ONT FL-16S与Illumina V3–V4测序结果，验证了前者在气管吸引物微生物分析中的应用价值。

INTRODUCTION
呼吸道微生物组在健康和疾病状态下的作用已被广泛研究。健康下呼吸道微生物组主要由口咽部菌群如链球菌(Streptococcus)、普雷沃菌(Prevotella)和韦荣球菌(Veillonella)构成。研究表明，微生物α多样性降低与特定病原体如流感嗜血杆菌(Haemophilus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas)的富集与疾病严重程度相关。危重症患者的肺部微生物组研究主要集中在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或重症肺炎的背景下，且多在机械通气的前1-2周内。对于需要气管切开的长期机械通气患者，其微生物组动态知之甚少。

16S rRNA基因测序是微生物组表征的金标准。第二代测序平台如Illumina因其高通量和低成本被广泛使用，但短读长测序缺乏物种水平的分辨率。虽然宏基因组测序能提供全面的物种信息，但由于呼吸道样本中宿主DNA占比超过99%，测序成本高昂。ONT平台具有便携性、实时测序和低成本等优势，其FL-16S测序可提供更高的物种分辨率。然而，ONT读长的较高错误率(4%-8%)限制了其应用。近年来，化学改进(Q20+)和R10.4.1流动池使读长准确率提升至约99%，且专门开发的生物信息学流程如Emu进一步提高了分析准确性。

RESULTS
DNA提取试剂盒和测序方法对参考标准菌群组成的影响
使用包含8种细菌的参考菌群评估了三种DNA提取试剂盒(Qiagen QIAamp、Zymo HostZero和ThermoFisher Magmax)的性能。MagMax和Qiagen试剂盒提取的DNA浓度相似(中位数12 μg/mL)，而Zymo试剂盒因宿主DNA去除步骤导致DNA浓度低于0.1 ng/μL。V3–V4测序显示，各试剂盒能有效裂解革兰氏阳性菌，90%的细菌可在属水平正确分类，但相对丰度与理论组成存在偏差。FL-16S测序则实现了物种级分辨率，其中MagMax提取的样本最接近理论组成(组内相关系数~0.85)。Zymo试剂盒的宿主去除步骤导致部分革兰氏阴性菌丢失。

气管吸引物中V3–V4 Illumina和FL-16S rRNA Nanopore微生物多样性分类比较
对5例患者的气管吸引物样本分析显示，Qiagen和MagMax试剂盒提取的样本微生物组成相似，而Zymo试剂盒提取的样本变异较大，尤其是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)占优势的样本。FL-16S测序结果与V3–V4测序高度一致。进一步对31例样本的分析表明，FL-16S测序在属水平与短读长测序结果相似，但提供了更高的物种分辨率。Emu流程的低丰度物种需通过0.1%相对丰度阈值过滤以减少噪声。

α和β多样性分析显示，两种测序方法在属水平结果相似。值得注意的是，尽管FL-16S测序提高了分类分辨率，但物种水平的Shannon多样性并未显著增加，表明多数样本中每个属仅由单一物种主导。FL-16S测序成功鉴定了临床相关病原体如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。此外，口腔菌群如链球菌和普雷沃菌在样本中表现为多物种共存。

DISCUSSION
本研究验证了ONT FL-16S测序在气管吸引物微生物组分析中的应用。MagMax试剂盒在DNA提取效率和准确性上表现最佳。FL-16S测序与Emu流程的组合在低多样性样本中与V3–V4测序结果相当，但提供了更高的物种分辨率。对于口腔菌群等复杂群落，FL-16S测序能更好地区分近缘物种。

该技术的局限性包括Emu流程对低丰度物种的识别需谨慎，且参考数据库的覆盖范围可能影响未知微生物的鉴定。然而，其在呼吸道感染病原体快速鉴定和生态研究中的潜力显著，尤其适用于需要物种级分辨率的临床和科研场景。

MATERIALS AND METHODS
样本来自美国宾夕法尼亚州的观察性队列研究，采集气管切开患者的吸引物并使用Sputasol降低粘度。DNA提取采用三种试剂盒，并通过qPCR评估16S/18S rRNA比率。FL-16S测序使用27F-1492R引物，ONT GridION平台完成；V3–V4测序使用Illumina MiSeq平台。数据分析分别采用Emu和QIIME2流程，统计使用R语言完成。