基于蛋白智能模型提升溶菌酶RPL187的热稳定性

　　

摘要：

目的 溶菌酶可作为抑菌剂而广泛应用于食品、生物、医药等领域。但溶菌酶作为一种生物活性物质，其稳定性受温度影响较大，难以满足不同行业的需求。因此采用一种结合人工智能模型设计并筛选蛋白质突变体的改造策略，提高溶菌酶的热稳定性，扩大溶菌酶的实际应用范围。 方法 研究材料为瘤胃原虫基因组来源的溶菌酶RPL187，通过大肠杆菌异源表达蛋白质进行后续实验，利用国标法检测溶菌酶RPL187在不同温度（37、45、50、55 ℃）处理不同时间（0、1、2、4、8 h）下剩余酶比活的变化情况；基于人工智能模型生成并筛选RPL187的多点突变体，同样利用国标法检测溶菌酶突变体在不同温度处理不同时间下剩余酶比活的变化情况，并通过测定野生型与突变体T_m值、自由能、氢键数量、二级结构含量等变化进而研究热稳定性提高的机制。 结果 RPL187在37 ℃和pH 6.5条件下的酶比活为（142 000±2 000）U/mg，比蛋清溶菌酶高5倍；RPL187在37 ℃和45 ℃条件下较稳定，但随着温度升高和热处理时间延长，酶比活出现明显下降的情况，在55 ℃条件下孵育1 h，酶比活下降88%左右；为了提高RPL187的热稳定性，基于人工智能模型共筛选11个RPL187多点突变体；有7个突变体成功在大肠杆菌中可溶性表达，其中RPL187-592和RPL187-209具有抑制藤黄微球菌的活性；进一步热稳定性的检测结果显示，RPL187-592和RPL187-209在50 ℃下经热处理8 h后剩余酶比活较野生型分别高4.43倍和2.29倍，T_m值较野生型分别提高2.06 ℃和2.41 ℃，并且自由能较野生型分别降低1.57 kcal/mol和0.43 kcal/mol，表现出较野生型更稳定的构象和更高的热稳定性。与野生型相比，突变体RPL187-592的分子内氢键增加了3个，且氨基酸由亲水向疏水的转变（K2V和K137V）均有助于提高蛋白质的热稳定性；而在RPL187-209中，可能是由于氨基酸由柔性向刚性（K78P和K108P）以及由亲水向疏水（K137A）的转变而增加热稳定性。 结论 本改造策略可以有效提高蛋白质热稳定性，对于扩大溶菌酶应用范围的实际需求有着重要意义，同时也为相关研究提供可参考的依据。