DSS1通过抑制自噬激活EMT促进肾透明细胞癌转移的新机制

《Nature Communications》：DSS1 inhibits autophagy to activate epithelial-mesenchymal transition in a pro-metastatic niche of renal cell carcinoma

本研究针对肾透明细胞癌(ccRCC)转移机制不明的临床难题，发现DNA修复辅因子DSS1在转移性ccRCC中异常高表达。研究人员通过多组学分析结合实验验证，揭示DSS1通过TRIM25介导的LC3B-K51位点K63连接多聚泛素化降解，抑制自噬流，导致p62积累和TWIST1稳定，进而激活上皮-间质转化(EMT)。该发现不仅阐明了DSS1hi肿瘤细胞在血管化侵袭微环境中的促转移作用，还为晚期ccRCC的治疗提供了新的靶点策略。

　　

肾透明细胞癌(ccRCC)作为最常见的肾脏恶性肿瘤，占所有肾癌病例的70%以上。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗取得了显著进展，但转移性ccRCC患者的5年生存率仍低于10%，治疗耐药和肿瘤转移成为临床面临的主要挑战。尤其令人困惑的是，为什么某些肿瘤细胞能够获得转移特性，在远离原发灶的部位形成新的肿瘤殖民地？这一过程涉及复杂的分子机制和肿瘤微环境的重编程，其中上皮-间质转化(EMT)被认为是癌细胞获得转移能力的关键步骤。然而，驱动ccRCC中EMT激活的具体分子通路及其与肿瘤微环境的相互作用仍不清楚。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，重庆医科大学的研究团队通过整合多组学数据、临床样本分析和动物模型，发现了一个意想不到的转移驱动因子——DSS1（Deleted in Split hand/Split foot protein 1）。传统上，DSS1被认为是BRCA2在DNA修复中的关键辅因子，但本研究揭示了它在ccRCC转移中的全新功能。

研究人员发现DSS1在转移性ccRCC中显著上调，与患者不良预后密切相关。机制研究表明，DSS1通过直接与LC3相互作用，促进TRIM25介导的LC3B第51位赖氨酸(K51)的K63连接多聚泛素化修饰，导致LC3通过蛋白酶体途径降解。这一过程抑制了宏观自噬流，引起自噬接头蛋白p62的积累，进而稳定了EMT关键转录因子TWIST1，促进其核转位，最终激活EMT程序。

研究还通过单细胞转录组和空间转录组分析，鉴定出一群DSS1高表达(DSS1hi)的肿瘤细胞，这些细胞在晚期肿瘤中富集，并与肿瘤-基质界面的血管化侵袭微环境相关。特别值得注意的是，DSS1hi细胞通过SPP1-ITGB1信号与微血管内皮细胞进行通信，形成促进转移的微环境niche。

技术方法上，本研究主要运用了转录组学分析（TCGA、GEO数据集）、免疫组织化学、免疫印迹、免疫共沉淀、GST pull-down、体外泛素化实验、透射电镜、单细胞RNA测序（10x Genomics平台）、空间转录组学（包括细胞类型反卷积分析）以及小鼠转移模型（尾静脉注射和皮下移植模型）等多种技术手段。临床样本来源于重庆医科大学第一附属医院的患者组织标本。

DSS1上调与ccRCC肿瘤转移相关

研究人员通过整合分析发现DSS1是ccRCC中的转移相关基因。比较分析显示，与早期肿瘤和正常肾组织相比，晚期ccRCC中DSS1 mRNA和蛋白水平均异常上调。生存分析表明DSS1高表达是ccRCC患者的不良预后因素。体内实验证实，敲低DSS1显著抑制了ccRCC细胞的肺转移能力，而过表达DSS1则增强了非转移性ccRCC细胞的转移潜能。此外，DSS1还通过促进细胞增殖和肿瘤生长，在ccRCC进展中发挥促癌作用。

DSS1通过阻断自噬流促进ccRCC细胞迁移和侵袭

通路富集分析提示自噬可能是DSS1在ccRCC转移中负调控的关键通路。基因集富集分析(GSEA)在多个数据集中一致显示DSS1高表达与自噬通路负相关。透射电镜显示DSS1沉默的ccRCC细胞中自噬泡积累增加。DSS1敲低还导致LC3斑点形成和LC3-LAMP1共定位显著增加，支持DSS1作为自噬流的负调控因子。Transwell实验表明DSS1沉默显著抑制了ccRCC细胞的侵袭和迁移能力，而DSS1过表达则增强这些过程。在氯喹(CQ)存在下，DSS1沉默和对照细胞间的侵袭和迁移差异不再显著，表明DSS1以自噬依赖的方式调控侵袭和迁移。

DSS1通过自噬抑制驱动上皮-间质转化(EMT)

研究人员发现DSS1介导的自噬抑制通过TWIST1稳定化导致EMT激活。DSS1沉默降低了TWIST1蛋白水平，而在CQ存在下，DSS1沉默和对照细胞间的TWIST1水平相当，表明DSS1通过自噬调控调节TWIST1蛋白水平。挽救实验证实TWIST1在DSS1介导的EMT中起关键作用。体内实验显示DSS1敲低导致肺转移病灶中p62和TWIST1蛋白水平降低，同时LC3和E-钙黏蛋白水平增加。进一步机制研究表明，DSS1通过抑制自噬促进p62积累，从而稳定TWIST1并增强其与Bcl-2的关联，促进TWIST1核转位，有助于EMT激活。

DSS1与LC3相互作用并促进TRIM25介导的LC3多聚泛素化降解

机制研究发现DSS1通过mTOR非依赖途径抑制自噬。免疫共沉淀实验证明DSS1与LC3存在物理相互作用，这一发现通过GST pull-down实验进一步验证。DSS1敲低或蛋白酶体抑制剂MG-132处理导致总LC3和泛素化LC3B水平增加，表明DSS1敲低损害了LC3降解。免疫荧光分析显示DSS1和LC3与蛋白酶体标志物PSMD3的共定位主要发生在细胞质中。LC-MS/MS分析鉴定出TRIM25是介导LC3泛素化的E3泛素连接酶，实验证实TRIM25直接介导LC3B在赖氨酸51位的K63连接多聚泛素化。

ccRCC中DSS1驱动细胞的功能状态和临床价值

单细胞转录组分析揭示了DSS1驱动细胞在ccRCC中的临床相关性。研究发现DSS1表达在恶性上皮细胞中显著高于正常肾上皮细胞。DSS1位于染色体7q21.3，其表达受拷贝数变异状态影响。功能模块分析显示DSS1hi细胞比其他恶性细胞具有更高的EMT模块评分和更低的自噬评分。在初治患者中，DSS1hi细胞的频率在IV期肿瘤中显著高于早期肿瘤。预后分析表明DSS1驱动细胞特征评分高的患者生存结局显著更差。值得注意的是，DSS1驱动细胞与抗VEGFR治疗耐药相关，在接受舒尼替尼治疗的患者中特征评分更高。

DSS1驱动细胞通过侵袭相关配体-受体相互作用与微血管内皮细胞通信

空间转录组分析揭示了DSS1驱动细胞的空间分布和微环境背景。细胞类型反卷积显示，在不同肿瘤分期的空间点中，微血管内皮细胞最常与DSS1驱动细胞共定位。细胞-细胞通讯分析发现，VEGF-VEGFRI/R2、SPP1-ITGA5/ITGB1、ANGPTL4-ITGA5/ITGB1和FN1/COL4A1/COL4A2-SDC4等配体-受体对在DSS1驱动细胞和微血管细胞间反复出现。这些配体-受体对的共表达在晚期病变中富集，而早期病变中点中的相互作用较弱。多重免疫组化证实DSS1驱动肿瘤细胞自噬减少，在肿瘤-基质界面的血管化侵袭微环境中富集，与CD105阳性微血管内皮细胞空间接近，有SPP1-ITGB1相互作用的证据。

研究结论与意义

本研究通过整合转录组数据集、患者来源组织和动物模型，证明了DSS1在ccRCC中普遍上调并促进转移进程。机制上，DSS1通过与LC3相互作用，促进TRIM25介导的LC3B第51位赖氨酸的K63连接多聚泛素化，导致LC3降解，损害宏观自噬流，引起p62积累和TWIST1稳定化，从而增强其核转位并激活EMT。研究人员鉴定出一群以DSS1高表达为特征的ccRCC细胞亚群，这些细胞在晚期和转移性肿瘤中富集，位于肿瘤-基质界面，通过VEGF-VEGFRs和SPP1-ITGB1/ITGA5等侵袭相关配体-受体对与微血管内皮细胞进行通信。

该研究的重要意义在于揭示了自噬抑制在ccRCC转移中的新机制，提出了DSS1作为VHL缺失背景下替代效应器的功能。研究发现DSS1驱动的细胞通过替代性血管生成信号通路（如SPP1-ITGB1）参与抗血管生成治疗耐药，为克服临床耐药提供了新思路。尽管直接靶向DSS1或TWIST1面临挑战，但研究提出的联合策略（如蛋白酶体抑制剂与自噬激动剂联用）为治疗DSS1驱动肿瘤提供了潜在方向。

总的来说，这项研究不仅深化了对ccRCC转移机制的理解，鉴定出DSS1驱动细胞作为潜在治疗靶点，还为开发针对晚期ccRCC转移的治疗策略提供了重要理论基础。该模型强调了肿瘤微环境中空间定位的细胞亚群通过特定分子机制驱动疾病进展的重要性，为未来精准医疗策略的开发提供了新的视角。