微藻连续培养中Manoyl-oxide的原位提取工艺优化及其对光响应机制的启示

本研究针对微藻异源二萜生产过程中产物抑制和提取效率低下的问题，通过构建C. reinhardtii UVM4工程菌株，在光生物反应器中建立连续生产-原位提取（milking）系统。结果表明优化提取面积（a=362.7 cm2 L-1）可使Manoyl oxide（MO）产率达6.7 mg L-1 d-1，揭示提取能力是限制MEP（2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸）途径效率的关键因素，为微藻绿色细胞工厂设计提供新思路。

　　

在追求可持续发展的时代，利用微生物细胞工厂生产高价值化合物成为研究热点。其中，二萜类化合物（diterpenes）作为植物天然产物，在医药、香料和生物燃料等领域具有重要应用价值。然而传统植物提取法效率低下，化学合成又面临立体选择性差的难题。微藻因其高效光合能力和遗传可操作性，被视为理想的绿色合成平台。但如何实现产物的高效连续生产，同时避免产物积累导致的反馈抑制，一直是制约微藻合成生物学应用的瓶颈问题。

针对这一挑战，来自荷兰瓦赫宁根大学（Wageningen University）的研究团队在《Algal Research》发表重要成果。研究人员选择模式微藻Chlamydomonas reinhardtii UVM4为底盘细胞，通过表达异源二萜合酶（diTPSs）和改造MEP途径，构建了能合成13R(+) manoyl oxide（MO）的工程菌株。研究创新性地将光生物反应器培养与两相萃取系统结合，系统评估了光照强度、生物量浓度和液-液接触面积对MO生产效率的影响。

关键技术方法包括：1）使用Algaebator和定制光生物反应器（Infors/Algaemist）进行多尺度培养；2）建立浊度恒定（turbidostat）连续培养系统；3）采用dodecane溶剂进行原位提取；4）通过GC-FID定量分析MO产量；5）构建包含细胞内合成（r_{MOEXT）的动力学模型。}

【3.1 初步实验】在摇瓶体系中，高光强（636 μmol m^-2 s^-1）与低光强（318 μmol m^-2 s^-1）下的MO产率无显著差异（6.2 vs 6.7 mg L^-1 d^-1），提示可能存在光饱和效应。

【3.2 连续生产】光生物反应器实验揭示关键发现：1）最佳生物量浓度1.37 g L^-1时，MO总产率1.2 mg L^-1 d^-1；2）当光强提升至1877 μmol m^-2 s^-1时，98%的MO被萃取至dodecane相，产率提升50%；3）比生长速率（μ_X）与PFD_sp（比光通量）呈正相关。

【3.3 提取面积效应】最具突破性的发现是MO产率与体积萃取面积（a）呈线性关系：摇瓶（a=362.7 cm² L^-1）的产率是反应器（a=18.7 cm² L^-1）的7.5倍，证明界面传质是限速步骤。动力学模型显示，当水相MO浓度（m_MO^AQ）超过4.5×10^-4 g L^-1时会显著抑制合成。

这项研究的重要意义在于：首次量化了微藻二萜生产体系中"细胞工厂-培养基-萃取相"三者的动态平衡关系，证明提高光强只能有限提升产率（25%），而优化萃取效率可实现数量级提升。该成果为设计规模化微藻生物反应器提供了关键参数：在保证PFD_sp>17.5 μmol s^-1 g^-1基础上，应优先扩大液-液接触面积至300 cm² L^-1以上。研究还创新性地提出"milking"工艺的传质-抑制耦合模型，为其他疏水性代谢产物的连续生产提供了理论框架。