新型抗河马podoplanin单克隆抗体PMab-322的研发及其在病理分析中的应用

本研究针对河马podoplanin（hipPDPN）特异性抗体缺乏的问题，通过细胞免疫筛选技术（CBIS）成功开发出高特异性单克隆抗体PMab-322（IgG2a，κ型）。该抗体对hipPDPN具有中等亲和力（KD 4.4×10?8 M），可应用于流式细胞术、免疫印迹和免疫组化，为河马组织病理分析及跨物种进化研究提供关键工具。

　　

在生命科学领域，河马作为鲸类近缘物种的独特进化地位一直备受关注，但其分子生物学研究却因缺乏特异性工具抗体而进展缓慢。尤其对于podoplanin（PDPN）——一种在肺泡上皮、淋巴内皮等组织中广泛表达的糖基化跨膜蛋白，其河马同源物（hipPDPN）的功能研究长期空白。这一问题不仅阻碍了河马自身疾病的病理分析，更限制了通过比较生物学揭示水生哺乳动物特殊适应机制的探索。

日本东北大学（Tohoku University）的研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》发表的研究中，采用细胞免疫筛选技术（CBIS）成功开发出首个抗hipPDPN单克隆抗体PMab-322。这项突破性工作为解析河马呼吸系统、皮肤等组织的分子特征提供了关键工具，同时为鲸-河马进化分支的适应性研究开辟了新路径。

研究团队主要运用三大关键技术：1）基于CHO-K1细胞系的hipPDPN过表达系统构建；2）流式细胞术高通量筛选杂交瘤；3）结合免疫印迹和免疫组化的多平台验证体系。通过BALB/c小鼠免疫和杂交瘤融合，最终从958个候选克隆中筛选出特异性识别hipPDPN的PMab-322。

3.1 抗hipPDPN抗体的开发
通过CHO/MAP16-hipPDPN免疫小鼠并融合脾细胞与骨髓瘤细胞，经流式筛选获得唯一特异性克隆PMab-322（IgG_2a, κ），其识别表位与23个其他物种PDPN无交叉反应。

3.2 流式细胞分析
PMab-322在0.01-10 μg/mL浓度范围内均能特异性结合CHO/PA16-hipPDPN，计算得出中等亲和力（K_D 4.4×10^?8 M），为后续功能研究奠定基础。

3.3 物种特异性验证
在包含鲸、熊、熊猫等24种哺乳动物PDPN的CHO-K1表达系统中，PMab-322仅识别河马源PDPN，证实其高度物种特异性。

3.4-3.5 多平台应用验证
免疫印迹检测到hipPDPN特征条带（48-63 kDa），免疫组化显示细胞膜特异性染色，证明该抗体适用于不同实验场景。

这项研究首次建立的PMab-322填补了河马分子生物学研究工具空白，其意义体现在三方面：首先，为河马SARS-CoV-2感染等疾病的病理机制研究提供关键试剂；其次，通过比较河马与鲸类PDPN的差异，有助于揭示水生适应过程中肺泡上皮和皮肤组织的进化规律；最后，CBIS技术路线为其他珍稀物种抗体制备提供了范式。值得注意的是，尽管河马与鲸类存在共同祖先（Cetancodonta），但PMab-322与抗鲸PDPN抗体PMab-237无交叉反应，暗示二者可能在皮肤和肺组织适应机制上存在分子层面的趋异进化。这些发现为后续开展水生哺乳动物比较基因组学研究提供了新的切入点。