大黄素衍生物 Rhein 通过靶向抑制 TGF-β/Smad3 信号通路磷酸化改善肾间质纤维化的机制研究

本研究针对肾间质纤维化（RIF）治疗难题，通过建立 UIRI 大鼠模型和 TGF-β1 诱导的 NRK-52E/HK-2 细胞模型，结合分子对接和生物层干涉技术，首次揭示中药活性成分 Rhein 通过特异性抑制 Smad3 磷酸化阻断 TGF-β/Smad 信号通路，显著改善肾功能并减少细胞外基质（ECM）沉积。该研究为开发靶向 Smad3 的抗纤维化天然药物提供新策略。

　　

肾脏疾病终末期的核心病理特征——肾间质纤维化（RIF）一直是临床治疗的重大挑战，其本质是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路异常激活导致的细胞外基质（ECM）过度沉积。尽管已知Smad3蛋白在TGF-β/Smad经典通路中起关键作用，但如何精准干预其磷酸化过程仍缺乏有效手段。传统中药大黄中的蒽醌类化合物Rhein（1,8-二羟基-3-羧基蒽醌）虽显示出多器官抗纤维化潜力，其具体分子机制却始终未能阐明。

温州医科大学的研究团队在《Chinese Herbal Medicines》发表的最新研究中，通过整合动物模型、细胞实验和生物物理技术，系统揭示了Rhein抗肾纤维化的精确靶点。研究人员首先建立单侧缺血再灌注损伤（UIRI）大鼠模型模拟RIF进程，同时采用TGF-β1刺激的NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞和HK-2人近端肾小管上皮细胞构建体外纤维化模型。通过MTT法确定药物浓度后，运用Western blot、免疫荧光染色等技术检测ECM相关蛋白表达，结合siRNA基因沉默和过表达实验验证靶点特异性，最后采用分子对接和生物层干涉（BLI）技术解析相互作用机制。

3.1. Rhein的体外抗纤维化活性
细胞实验显示2.5 μmol/L Rhein能显著抑制TGF-β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原和纤连蛋白表达，免疫荧光证实该剂量可有效减少α-SMA阳性细胞。值得注意的是，36小时被确定为TGF-β1诱导的最佳建模时长，此时ECM蛋白表达达到峰值。

3.2. TGF-β/Smad通路调控机制
Western blot结果显示Rhein处理组磷酸化Smad3（p-Smad3）水平显著降低，而总Smad3蛋白不变。与阳性对照Smad3抑制剂SIS3·HCl相比，Rhein表现出相当的Smad3磷酸化抑制能力。免疫荧光进一步观察到p-Smad3核转位减少，提示Rhein可能阻断Smad3的活化过程。

3.3. Smad3基因功能验证
通过siRNA敲低HK-2细胞的Smad3基因后，Rhein的抗纤维化效应明显减弱；反之，Smad3过表达则增强其作用。这一基因操控实验直接证明Smad3是Rhein发挥作用的关键靶点。

3.4. 动物模型疗效验证
UIRI大鼠经80 mg/kg Rhein干预14天后，血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平显著改善，Masson染色显示肾间质胶原沉积减少。免疫组化证实治疗组肾脏p-Smad3和α-SMA表达下调，且高剂量组效果优于低剂量组（50 mg/kg）。

3.6. 分子相互作用解析
计算机模拟显示Rhein通过Gly-359、Phe-362等氨基酸残基与Smad3蛋白结合，形成氢键和π-π共轭，结合能达-6.8 kcal/mol。BLI实验测得平衡解离常数4.47×10^-5 mol/L，证实两者存在直接相互作用。

这项研究首次阐明Rhein作为天然Smad3磷酸化抑制剂的分子机制，其通过占据Smad3的MH2结构域（Mad homology 2 domain）疏水裂隙，竞争性阻断TGF-β1诱导的Smad3活化。相较于现有靶向TGF-β受体或下游基因的疗法，这种直接干预关键信号节点的策略更具特异性。研究还发现Rhein能同时上调抑制型Smad7表达，形成双重调控，这为开发多靶点抗纤维化药物提供了新思路。

从转化医学角度看，该研究不仅为中药现代化研究提供范式——通过"成分-靶点-通路"的清晰解析将传统药材转化为精准治疗药物，更重要的是发现Smad3磷酸化位点可作为"药物口袋"设计新型抑制剂。鉴于TGF-β/Smad3通路在肺、肝等多器官纤维化中的共性作用，这一发现可能拓展至其他纤维化疾病治疗领域。未来研究可进一步优化Rhein衍生物的药代动力学特性，推动其向临床转化，为终末期肾病患者带来新的治疗希望。