一种高效中链选择性脂肪酶在毕赤酵母中的异源表达及其在奶酪生产中的应用

为解决奶酪生产中传统脂肪酶释放长链脂肪酸导致不良风味及动物源酶制剂不符合素食/清真需求的问题，研究人员成功在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达金顶侧耳菌（Pleurotus citrinopileatus）来源的中链选择性脂肪酶PCI-Lip。该酶对辛酸酯（pNPO）的催化效率（kcat/Km=5.99×105 M?1?S?1）较大肠杆菌表达体系提升472倍，5L发酵罐规模产量达5.05×105 U?g?1。GC-MS证实其特异性释放辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）和月桂酸（C12:0）能增强奶酪奶油风味，分子动力学模拟揭示其底物选择性由盖状结构域（Cys65-Ser98）的立体位阻调控。该研究为开发符合特殊膳食需求的高效奶酪加工酶制剂提供了新策略。

　　

奶酪独特风味的形成离不开脂肪酶对甘油三酯的水解作用，但现有技术面临两难困境：微生物脂肪酶（如Rhizomucor miehei来源的Piccantase A）倾向释放长链脂肪酸，易产生肥皂味副产物；而传统动物源脂肪酶（如小羊颌下腺分泌的PGEs）又无法满足素食、清真等特殊膳食需求。更棘手的是，前期研究发现金顶侧耳菌（Pleurotus citrinopileatus）分泌的中链选择性脂肪酶PCI-Lip虽能精准释放辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）等风味前体物质，但在大肠杆菌表达系统中产量极低，严重制约其工业化应用。

来自陕西省科学院生物农业研究所的研究团队另辟蹊径，选择具有真核蛋白修饰能力的毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33作为宿主，通过密码子优化和发酵工艺创新，成功实现PCI-Lip的高效分泌表达。研究显示，重组表达的PpPCI-Lip对p-硝基苯辛酸酯（pNPO）的催化效率参数k_cat/K_m达到5.99×10⁵ M^?1?S^?1，较大肠杆菌系统提升472倍。在5升发酵罐规模下，酶产量突破0.123 g/L，体积活性达5.05×10⁵ U?g^?1，较摇瓶发酵提高3.17倍。

关键技术方法
研究采用毕赤酵母分泌表达系统构建重组菌株，通过免疫亲和层析（IMAC）和分子排阻色谱（SEC）纯化目标蛋白；使用p-硝基苯酯类底物（pNPA/pNPB/pNPO等）测定酶动力学参数；采用GC-MS分析奶酪中游离脂肪酸谱；运用分子动力学模拟（MD simulations）解析盖状结构域（lid region，Cys65-Ser98）的构象变化与底物选择性关系。

表达与纯化
SDS-PAGE证实重组PpPCI-Lip分子量为58 kDa，与预测值一致。SEC色谱显示该酶可能存在多聚体形式，动态光散射（DLS）测定其水合粒径为10.8 nm。

酶学特性
PpPCI-Lip最适作用温度为40°C，在25-45°C保持80%以上活性。其pH稳定性范围（pH 5.0-9.0）显著优于商业脂肪酶Palatase 20,000 L。对中链底物pNPO的催化效率是长链底物pNPP的38.7倍。

应用评价
在切达奶酪模型中，PpPCI-Lip处理组释放的辛酸（C8:0）和癸酸（C10:0）分别达到Palatase组的2.3倍和1.8倍，而长链脂肪酸（如油酸C18:1）释放量降低61%。感官评价显示其能显著增强奶酪的奶油和果香风味。

分子机制
通过200 ns分子动力学模拟发现，PCI-Lip的盖状结构域存在"选择性门控"机制：中链甘油三酯（如三癸酸甘油酯C10:0）因分子体积较小，可顺利通过由Cys65-Ser98形成的通道进入活性中心；而长链底物（如三油酸甘油酯C18:1）则因空间位阻和疏水聚集效应被阻挡在外。

这项发表于《Food Chemistry》的研究具有三重突破意义：首先，建立了首个能工业化生产真菌源中链选择性脂肪酶的毕赤酵母表达系统；其次，通过结构生物学手段阐明了脂肪酶底物选择性的动态调控机制；最重要的是，为开发符合伦理需求的奶酪加工酶制剂提供了全新解决方案。正如通讯作者Binglin Li强调的，这种"精准脂肪酶"技术有望拓展至其他发酵食品领域，实现风味物质的可控释放。