植物外向整流钾离子通道GORK的CNBD-Ankyrin桥结构重排调控机制解析

（编辑推荐）本研究通过冷冻电镜解析拟南芥保卫细胞外向整流钾通道GORK的五种构象，首次揭示其胞质区CNBD-Ankyrin桥的α螺旋/非螺旋转换通过调控C-linker对称性（C4/C2）决定通道预开放态，为植物气孔关闭的K+外排机制提供结构基础。

　　

结构揭示GORK通道的调控机制

Significance
拟南芥保卫细胞外向整流钾通道GORK通过释放K⁺调控气孔关闭，但其活性调控机制长期未明。研究团队通过冷冻电镜捕获GORK从紧密关闭态到预开放态的转变，首次发现胞质区环核苷酸结合域（CNBD）与锚蛋白重复域（ANK）间的8个氨基酸（511-519）构成的CNBD-Ankyrin桥，其α螺旋与非螺旋结构的转换是区分通道预开放态与其他关闭态的关键。

结构特征与构象多样性
研究解析了分辨率为3.16-3.27 ?的五个GORK构象（GORK_WT1-GORK_WT5）。跨膜区（S1-S6）呈现刚性四重对称（C4），而胞质区C-linker（314-364）、CNBD（365-490）、CNBD-Ankyrin桥（491-542）和ANK（543-722）则显示动态二重对称（C2）。值得注意的是，GORK_WT1中CNBD-Ankyrin桥形成α螺旋，推动C-linker上移形成类C4对称；而GORK_WT5中该区域变为非螺旋环，导致明显C2对称。

关键残基的功能验证
C-linker中精氨酸（R320/R337/R348）与S4-S5环的静电相互作用调控通道活性：R320A突变完全丧失K⁺转运能力，R337A/R348A活性降低。CNBD-Ankyrin桥的甘氨酸扫描显示，K514G/L516G/D519G突变显著抑制电流，其中D519与H523的氢键稳定α螺旋结构。分子动力学模拟证实，ABA诱导的CPK21磷酸化（pS518）通过与K515形成盐桥增强螺旋稳定性。

嵌合体实验揭示调控逻辑
将AKT1的CNBD-Ankyrin桥/ANK区域移植至GORK构建嵌合体GORK(CA-ANK)_AKT1后，该通道可被CIPK23/CBL1激酶复合物激活（+70 mV电流增强3倍），而反向嵌合体AKT1(CA-ANK)_GORK则丧失激酶响应性，表明ANK域作为蛋白互作平台通过调控CNBD-Ankyrin桥刚性影响通道对称性转换。

进化与调控启示
研究对比了含ANK域的GORK/SKOR与缺失ANK的KAT1/AKT1通道：前者需CNBD-Ankyrin桥介导的构象转换作为预开放"检查点"，后者可直接响应膜电压。跨膜区特有的保守带电残基（如S4-S5环E208、S5-S6环K240、S6螺旋D295）可能协同参与K⁺感应门控。该成果为设计作物抗旱气孔调控策略提供了分子靶点。

Materials and Methods
研究采用杆状病毒-Sf9系统表达带Flag/His标签的GORK蛋白，通过冷冻电镜（JEOL CRYO ARM 300 II）采集4,675张显微图像，CryoSPARC处理获得186,257颗粒。电生理实验在非洲爪蟾卵母细胞中完成，CD光谱分析采用合成磷酸化肽段（EKESNDRIKKLEpSDIVIHIG）。分子动力学模拟使用Amber22软件，力场参数涵盖磷酸化丝氨酸特性。