CRISPR/Cas9介导OPTN基因敲除通过下调自噬和线粒体自噬影响SOD1-G93A转基因细胞模型

本研究针对肌萎缩侧索硬化症(ALS)中自噬和线粒体自噬调控机制的关键问题，通过CRISPR/Cas9技术构建OPTN基因敲除的SOD1-G93A转基因细胞模型。研究发现OPTN缺失导致LC3-II减少、p62积累，同时VDAC1和TBK1表达下降，证实OPTN通过调控自噬流(autophagic flux)和线粒体膜电位(MMP)在清除异常线粒体中发挥核心作用。该研究为ALS等神经退行性疾病的治疗靶点提供了新依据。

　　

肌萎缩侧索硬化症（ALS）作为最常见的成人运动神经元退行性疾病，其发病机制与异常蛋白聚集和线粒体功能障碍密切相关。近年来研究发现，自噬（autophagy）和线粒体自噬（mitophagy）通路异常是ALS的重要病理特征，其中optineurin（OPTN）基因突变与家族性ALS密切相关。然而，OPTN在神经元中调控自噬的具体机制仍不明确，这成为制约ALS治疗靶点开发的关键科学问题。

针对这一研究空白，上海交通大学医学院的研究团队在《IBRO Neuroscience Reports》发表了创新性研究成果。他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在表达SOD1-G93A突变蛋白的NSC34运动神经元样细胞中构建了OPTN敲除模型，通过多维度实验揭示了OPTN通过调控自噬-溶酶体通路影响线粒体质量控制的新机制。

研究主要采用以下关键技术：1）CRISPR/Cas9设计3种sgRNA构建OPTN敲除细胞系；2）线粒体膜电位（MMP）检测和活性氧（ROS）荧光探针分析；3）免疫荧光共定位观察OPTN与VDAC1/TBK1的相互作用；4）Western blot检测自噬标志物LC3-II和p62的表达变化；5）巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）处理评估自噬流动态。

3.1 CRISPR/Cas9介导的OPTN基因编辑
研究人员设计3种sgRNA序列，其中sgRNA3敲除效率最高，使OPTN mRNA水平降低47.2%，成功建立OPTN部分敲除的ALS细胞模型。

3.2 OPTN敲除对细胞形态和活力的影响
OPTN敲除细胞呈现球形化形态改变，细胞体积缩小，活力显著下降（P<0.05），表明OPTN缺失导致细胞稳态失衡。

3.3 OPTN缺失损害线粒体功能
MitoTracker Red和MDC双染色显示线粒体自噬流减少。TMRM荧光检测发现线粒体膜电位（MMP）显著去极化（P<0.05），证实OPTN缺失导致线粒体功能受损。

3.4 ROS水平升高
DHE探针检测显示OPTN敲除细胞内ROS荧光强度增加（P<0.01），提示氧化应激加剧，这与自噬清除功能障碍的病理特征一致。

3.5 自噬-线粒体自噬通路阻断
免疫荧光显示OPTN与VDAC1/TBK1共定位减少。Western blot检测发现：LC3-II水平下降52%（P=0.041），p62积累增加（P=0.041），VDAC1和TBK1蛋白表达分别降低45%和38%。巴弗洛霉素A1处理实验进一步证实，OPTN敲除细胞的自噬流响应能力显著减弱。

这项研究首次在运动神经元样细胞中系统论证了OPTN通过双重调控基础自噬和线粒体自噬维持细胞稳态的分子机制。研究发现OPTN缺失会导致：1）自噬体形成障碍（LC3-II减少）；2） ubiquitin-p62-TBK1信号通路失调；3）线粒体质量控制失效（VDAC1表达下降和MMP去极化）。这些发现为理解ALS中OPTN突变致病的分子基础提供了直接证据，提示增强OPTN介导的自噬流可能是治疗ALS的新策略。

特别值得注意的是，研究创新性地将CRISPR/Cas9基因编辑技术与经典的自噬研究方法相结合，在SOD1-G93A转基因细胞模型中重现了人类ALS的病理特征。该模型为后续筛选靶向OPTN的小分子药物提供了理想平台。未来研究可进一步探索OPTN磷酸化修饰（如TBK1介导的S177位点）在调节自噬-溶酶体融合中的精确作用，为开发神经保护疗法提供新思路。