人工智能酶设计新突破：基于LmrR支架的远端热点预测计算流程开发

本研究针对人工酶催化效率不足的难题，开发了整合残基网络分析、变构通路映射和机器学习功能位点预测的开源计算流程。以LmrR支架人工酶为模型，通过筛选20个单点突变获得活性提升20%、热稳定性提高12.5°C的Y27H突变体，双突变体更实现50%活性增益和22.7°C热稳定性突破，为酶工程提供了全新计算策略。

　　

在工业生物催化领域，天然酶的性能局限始终是制约其应用的瓶颈。虽然非经典氨基酸（ncAAs）的引入拓展了酶催化反应的边界，但人工酶较天然酶仍存在催化效率低、热稳定性差等缺陷。传统酶工程多聚焦活性位点优化，而近年研究发现，远离活性中心的远端突变（distal mutations）可通过变构效应显著影响酶功能。如何系统预测这些"隐秘"的调控位点，成为提升人工酶性能的关键科学问题。

针对这一挑战，研究人员开发了一套创新的计算预测流程。该研究以乳球菌多药耐药调节因子（Lactococcal multidrug resistance regulator, LmrR）为模型支架——该蛋白因其出色的结构可塑性被广泛用于构建人工酶。研究团队通过整合三大核心技术：1）OHM变构耦合强度（ACI）算法识别潜在变构位点；2）Allopath信息流（IF）分析追踪变构信号传导路径；3）机器学习功能位点模型筛选关键残基。这套方法仅测试20个突变就锁定关键位点Y27，其组氨酸突变体（Y27H）使催化活性提升20%，热稳定性指标T₅₀¹⁰提高12.5°C。

【关键技术方法】
研究采用2.1μs分子动力学（MD）模拟分析构象动态，通过OHM计算残基变构耦合强度，Allopath解析信息流路径，结合基于GEMME和RaSP的机器学习功能位点预测。实验验证采用定点突变构建20个LmrR变体，通过紫外光谱法测定4-HBA与NBD-H的腙形成反应动力学参数，差示扫描法评估热稳定性。

【主要研究结果】

1. 计算流程设计
   开发的开源工作流依次执行：ACI计算筛选前15个变构位点→机器学习标注60个功能位点→交叉验证获得6个高置信位点→IF分析识别5个关键通讯残基（Y27、I31等）。值得注意的是，15/20的IF预测位点与商业软件Zymspot先前结果重合，验证了方法的可靠性。

2. 实验验证
   从5个预测位点设计的20个突变体中，Y27H表现最优：k_cat,app达5.21×10³ s^-1，较母体提高20%；双突变体N26A_Y27H更实现50%活性增益。热稳定性方面，Y27H_F54L双突变产生协同效应，T₅₀¹⁰提升22.7°C至68.9°C，显著优于单突变效果。

3. 分子机制解析
   MD模拟揭示Y27H通过增强α1-α2连接区与β-wing环间的氢键网络（R76-H27键频从13.6%增至40%）稳定结构。接触分析显示突变体新增E107-K110等关键相互作用，而活性提升的N26A_Y27H变体在催化中心（pAF15/H93等）形成更多接触，证实远端突变通过动态调控影响活性位点。

4. 构象动态调控
   聚类分析发现Y27H使非活性构象cis-front占比从26.4%降至<3.1%，促进活性构象trans和cis-back的富集，这与其催化效率提升直接相关。

【研究意义】
该研究首次将残基网络分析与机器学习预测相结合，建立了人工酶远端热点识别的标准化流程。其创新性体现在：1）发现DNA结合区α2螺旋（Y27等）是LmrR变构调控的关键枢纽；2）揭示"符号上位性"现象——N26A的 destabilizing效应可被Y27H补偿；3）提供开源工具替代商业软件Zymspot。这些发现不仅为LmrR人工酶的工业应用奠定基础，更为蛋白质理性设计提供了可推广的方法学框架。

论文发表于《International Journal of Biological Macromolecules》，其价值在于将计算预测与实验验证紧密结合，仅通过极小突变库（20个）即获得显著性能提升，大幅降低了酶工程的高通量筛选成本。未来该流程有望拓展至其他蛋白质设计领域，为开发高性能生物催化剂提供新范式。