德克萨斯州布朗菲尔德棉花卷叶矮缩病毒(CLRDV)新分离株的鉴定与基因组变异分析

这篇研究首次报道了来自德克萨斯州布朗菲尔德地区的棉花卷叶矮缩病毒(CLRDV)新分离株，通过RT-PCR扩增获得全长5838bp基因组序列（登录号PV548928）。研究采用系统发育分析和多序列比对揭示该分离株与俄克拉荷马州EC4株(OM687235.2)遗传相似性达99.69%，同时发现运动蛋白(MP)区域存在特征性氨基酸变异。通过MEME Suite鉴定的10个保守基序(E值<1e-241)为开发分子诊断标记提供了新靶点，热图分析显示德州西部CLRDV分离株形成独特进化分支，这对理解病毒区域适应性进化具有重要意义。

　　

背景
棉花(Gossypium hirsutum)作为全球最重要的经济作物之一，其生产持续受到棉花卷叶矮缩病毒(CLRDV)的威胁。这种属于Polerovirus属的病毒自2017年在美国阿拉巴马州首次发现后，已迅速扩散至包括德克萨斯州在内的14个产棉区。2024年生长季，研究团队在德克萨斯州布朗菲尔德地区的 symptomatic cotton plants exhibiting characteristic symptoms ranging from mild chlorosis to severe stunting and leaf curling.

材料与方法
样本采集后立即用液氮速冻保存于-80°C。采用Spectrum? Plant Total RNA Kit提取总RNA，通过基因特异性引物（JL0067/JL0068和JL0063/JL0068）进行RT-PCR扩增，获得312bp和432bp的特征条带。为获取全长序列，研究团队创新性地设计4对重叠引物，使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase扩增后，采用牛津纳米孔测序技术完成全长5838bp基因组测序（Plasmidsaurus公司完成）。

序列分析
新分离株PV548928与已知CLRDV分离株的全基因组相似性为90.58%-99.69%。系统发育分析采用TIM2e+G(4)+I进化模型，经1000次bootstrap检验显示该分离株与俄克拉荷马州EC4株(OM687235.2)聚为一支（支持率>90%）。热图分析揭示德州西部分离株（包括Lubbock PP556773和San Angelo PP556774）形成独特遗传簇，而与College Station(MN872302)等地的分离株存在显著差异。

蛋白特征
通过MAFFT比对鉴定的10个保守基序中，Motif 1(AGATAACTCAGTAGCTTGTTATAGCAGGAGCTCTTAA)和Motif 4(AACAATTTTGGAACAGTTTTTCTCGAGATCTGAAATCA)在14个分离株中完全保守（E值7.08e^-242）。运动蛋白(MP)区域检测到3个特异性氨基酸替换，可能影响病毒细胞间移动能力。生物信息学预测显示5'UTR区存在典型Polerovirus保守茎环结构。

讨论
研究发现CLRDV在德州西部呈现明显地理隔离进化特征，推测与当地棉花栽培品种差异和棉蚜(Aphis gossypii)种群动态相关。特别值得注意的是，P0蛋白（RNA沉默抑制子）在布朗菲尔德分离株中保持高度保守，这为开发广谱诊断试剂提供了理想靶标。研究同时发现病毒可能通过农事操作（如农机具传播）在区域内扩散。

结论
该研究首次绘制了德州西部CLRDV分离株的完整基因组图谱，鉴定的地理特异性分子标记为建立区域化监测体系奠定基础。发现的保守基序和特征性氨基酸变异为后续研究病毒-宿主互作机制提供了新线索。建议加强棉田周边杂草（如苘麻）的病毒筛查，并开展栽培品种抗性评价以应对CLRDV的持续进化威胁。