吡咯喹啉醌通过上调RFC/PCFT表达和PGC-1α/NRF-1通路改善叶酸缺乏诱导的血脑屏障损伤的神经保护机制

本研究针对脑叶酸缺乏(CFD)导致的血脑屏障(BBB)功能障碍问题，通过体外hCMEC/D3细胞模型和体内小鼠实验，首次揭示吡咯喹啉醌(PQQ)通过激活PGC-1α/NRF-1信号通路上调还原型叶酸载体(RFC)和质子偶联叶酸转运体(PCFT)表达，同时逆转叶酸缺乏(FD)引起的紧密连接蛋白下调、炎症因子释放和氧化应激，为CFD相关神经系统疾病提供了新型治疗策略。研究发表于《Fluids and Barriers of the CNS》。

　　

在神经系统发育和功能维持中，叶酸（维生素B₉）扮演着至关重要的角色。然而，当脑脊液中叶酸水平异常降低时，会导致一种被称为脑叶酸缺乏症(CFD)的严重儿科疾病，表现为神经炎症、氧化应激和认知功能障碍。传统观点认为叶酸主要通过脉络丛的血-脑脊液屏障(BCSFB)进入大脑，但近年研究发现血脑屏障(BBB)在叶酸转运中同样发挥重要作用。当BCSFB的叶酸受体α(FRα)功能受损时，BBB能否作为替代转运途径？叶酸缺乏又如何影响BBB的完整性？这些关键问题亟待解答。

来自加拿大多伦多大学(University of Toronto) Leslie Dan药学院的Sara Aboulhassane和Reina Bendayan团队在《Fluids and Barriers of the CNS》发表的研究，首次系统阐明了吡咯喹啉醌(PQQ)通过调控BBB叶酸转运系统和屏障完整性来改善CFD的分子机制。研究人员采用体外hCMEC/D3人脑微血管内皮细胞模型和体内C57BL6/N小鼠叶酸缺乏模型，结合qPCR、Western blot、ELISA和荧光素钠通透性检测等技术，发现PQQ能通过PGC-1α/NRF-1信号通路上调还原型叶酸载体(RFC)和质子偶联叶酸转运体(PCFT)，同时逆转叶酸缺乏导致的紧密连接蛋白破坏、炎症反应和氧化应激。

主要技术方法
研究采用5周叶酸缺乏饮食建立小鼠模型，通过10天PQQ腹腔注射(20 mg/kg/天)进行干预。体外实验使用hCMEC/D3细胞在叶酸充足(FS)或缺乏(FD)培养基中培养，分别用1μM和5μM PQQ处理24小时。关键技术包括：qPCR检测基因表达、Western blot分析蛋白水平、ELISA定量炎症因子、Ficoll梯度离心法分离脑毛细血管、荧光素钠(NaFl)通透性实验评估BBB完整性。

FD和PQQ处理对BBB叶酸转运体的影响
研究发现FD显著下调hCMEC/D3细胞中PCFT基因(~2倍)和蛋白表达，而RFC表达保持不变。引人注目的是，5μM PQQ处理使FS和FD条件下的RFC表达均增加1.5倍，同时使PCFT在FS和FD细胞中分别上调1.8倍和1.6倍。小鼠实验证实PQQ(20 mg/kg)可使脑毛细血管中Slc19a1(RFC)和Slc46a1(PCFT)基因表达均提高约2倍。

PGC-1α/NRF-1信号通路的激活
PQQ处理显著上调线粒体生物合成关键调控因子：在hCMEC/D3细胞中，NRF-1和PGC-1α表达增加1.5倍，其下游靶基因TFAM、TFB1M和TFB2M也相应上调；小鼠脑毛细血管中Nrf1和Ppargc1a分别增加2倍和2.5倍。这表明PQQ通过增强线粒体功能来维持BBB能量代谢。

炎症与氧化应激反应
FD导致hCMEC/D3细胞炎症因子基因表达显著升高：IL-6(2.5倍)、IL-8(3倍)、CXCL10(2.2倍)和CCL2(2.5倍)，ELISA检测显示相应蛋白水平也明显增加。PQQ处理能完全逆转这些效应。类似地，FD小鼠脑毛细血管中Il6、Cxcl10和Pecam-1基因表达分别增加1.8倍、2.8倍和2倍，PQQ干预后恢复至正常水平。氧化应激标记物NOS2/iNOS、NOX5和NOS3/eNOS在FD细胞中上调2.5倍、1.9倍和1.4倍，PQQ处理可使其恢复正常。

BBB完整性的变化
FD显著破坏紧密连接：hCMEC/D3细胞中TJP1(ZO-1)和OCLN基因表达分别下降2倍和1.6倍，蛋白水平也相应降低；小鼠脑毛细血管中Tjp1和Ocln表达减少2-2.3倍。NaFl通透性实验显示FD小鼠BBB渗透性显著增加，而PQQ处理使渗透性降低2倍，表明其能有效修复屏障功能。值得注意的是，CLDN5基因表达在FD细胞中反常增加3倍，可能是一种代偿机制。

研究结论与意义
该研究首次揭示：1)FD通过下调紧密连接蛋白和诱发炎症/氧化应激破坏BBB完整性；2)PQQ通过PGC-1α/NRF-1通路双重上调RFC和PCFT表达，为CFD治疗提供了新靶点；3)PQQ能同时改善BBB结构和功能，这种"一石三鸟"的作用机制使其成为极具前景的神经保护剂。特别是在FRα功能障碍的CFD患者中，PQQ诱导的BBB-RFC上调可能绕过BCSFB障碍，建立替代的叶酸输送途径。研究为开发CFD及相关神经退行性疾病的联合治疗方案提供了重要理论依据。