突破核边界限制：基于细胞形态特征的原位测序单细胞分析揭示人脑组织空间转录组特征

本研究针对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)人脑组织的原位测序(ISS)数据分析难题，创新性地整合荧光成像与核边界扩展算法，开发了基于IBA1蛋白和18S RNA标记的定向转录本分配策略。荷兰格罗宁根大学医学中心团队通过Xenium平台分析266个CNS相关基因表达，证实该方法显著提升小胶质细胞等复杂形态细胞的转录组检测特异性，为神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和多发性硬化症)的空间微环境研究提供了关键技术突破。

　　

在探索大脑奥秘的征程中，科学家们始终面临着一个关键挑战：如何在保留空间信息的前提下解析高度异质性的神经细胞网络。传统单细胞核RNA测序(sc/sn-RNAseq)虽能揭示细胞类型多样性，却像把拼图打散后丢失了每块的位置信息——这对于研究阿尔茨海默病(AD)淀粉样斑块周边微环境或多发性硬化症(MS)病灶的免疫浸润模式至关重要。更棘手的是，中枢神经系统(CNS)细胞具有极端复杂的形态学特征：小胶质细胞(IBA1⁺)的精细突起、神经元的树状分支、血管周细胞的紧密包裹，使得转录本的空间归属成为巨大难题。

荷兰格罗宁根大学医学中心(University Medical Center Groningen)的Janssen M.Kotah团队在《Communications Biology》发表的研究，开创性地将Xenium原位测序平台与定制化图像分析方法结合。研究人员利用10x Genomics人类脑组织面板(hBP)检测266个基因，通过对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)人脑样本的系统分析，比较了核边界(xeNuc)、扩展核边界(xeCell)和基于18S RNA/IBAL蛋白的形态学分割策略。研究发现，虽然常规核扩展算法能增加65%的转录本分配率，但会错误分配血管周细胞(VLMC)和内皮细胞的转录特征。通过整合后运行免疫荧光技术，团队建立的gsIBA/2°xeCell分级分配策略，使小胶质细胞检测数量提升38%，同时显著提高P2RY12、CX3CR1等特异性标记基因的富集度。

关键技术方法包括：1)使用Xenium平台对4例人脑FFPE样本进行原位测序；2)开发基于geopandas的空间分析流程，实现18S RNA和IBA1免疫荧光图像与转录组数据的配准；3)创建阈值化掩模分割算法优化细胞边界识别；4)采用二级分配策略处理未分配转录本。样本来源于荷兰脑库(NBB)，经DV200%质量筛选确保数据可靠性。

核边界分割识别所有人脑主要细胞类型
通过Xenium默认核分割(xeNuc)分析样本XE1，成功鉴定74，521个核的8个主要CNS细胞类群，但仅分配27.3%的转录本。扩展核边界至5μm(xeCell)使分配率提升至65.21%，但导致血管周细胞(VLMC)被错误注释为内皮细胞。将扩展距离调整为2.5μm可恢复VLMC检测，证实核扩展距离需根据细胞类型优化。

多模态分割提升基于形态的转录本分配
在样本XE2-4中，多组织染色试剂盒提供的18S RNA和膜标记物实现多模态分割(xeMultimodal)。18S导向的gs18S分割特异性富集神经元转录本(76.7%)，而E-cadherin染色帮助区分内皮细胞与VLMC。值得注意的是，多模态分割使小胶质细胞注释一致性降至66%，凸显特定标记物的必要性。

后运行免疫染色提供转录本分配特异性
样本XE1的IBA1免疫荧光后处理开创性实现小胶质细胞定向分割(gsIBA)。线性模型证实该方法显著提升AIF1(编码IBA1)等微胶质基因的分配特异性(FDR<0.001)。结合二级xeCell分配(2°xeCell)，最终构建的混合数据集包含10，427个小胶质细胞，其转录组分析显示gsIBA分割的细胞更富集P2RY12等特异性标记，而2°xeCell分割细胞则含较多少突胶质细胞基因(如MOBP)。

这项研究建立了灵活高效的FFPE脑组织空间转录组分析框架，其创新性体现在三个方面：首先，证实核扩展距离需根据神经血管单元等特殊结构定制化调整；其次，开发的后运行免疫染色兼容方案突破了平台原有分析限制；最后，分级分配策略为复杂形态细胞的转录组研究树立新标准。这些发现对神经退行性疾病研究具有深远影响——在AD研究中，该方法能精准解析淀粉样斑块周边DAM(disease-associated microglia)的时空演化；对于MS病灶，则有助于区分不同炎症阶段的少突胶质细胞亚群。研究提供的开源分析流程(https://github.com/jmkotah/xenium_segmentation_paper)将推动空间组学在临床样本中的应用，为开发靶向神经炎症的精准治疗策略奠定技术基础。