Wss1与Ddi1蛋白酶在氧化应激下修复DNA-蛋白质交联的作用机制及其在白色念珠菌致病性中的关键意义

这篇研究揭示了Wss1和Ddi1蛋白酶在酿酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans）中修复氧化应激诱导的DNA-蛋白质交联（DPCs）的核心作用，通过SDS/KCl沉淀实验证实了H2O2、NaOCl等氧化剂剂量依赖性增加DPCs水平，并证明缺失这两种蛋白酶的菌株对巨噬细胞杀伤更敏感，为真菌感染治疗提供了新靶点。

　　

Abstract
氧化应激是吞噬细胞杀伤微生物的主要机制，会导致包括DNA-蛋白质交联（DPCs）在内的分子损伤。本研究在模式酵母酿酒酵母和人类病原真菌白色念珠菌中，系统分析了Wss1和Ddi1蛋白酶在氧化应激条件下的功能。通过SDS/KCl沉淀实验直接检测发现，过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸钠（NaOCl）等氧化应激诱导剂能剂量依赖性增加两种真菌的DPCs水平。基因缺失实验表明，Wss1和Ddi1缺失株对氧化应激高度敏感，其中Wss1的催化活性不可或缺，而与Cdc48和SUMO的相互作用虽重要但非必需。尤为关键的是，白色念珠菌的Wss1和Ddi1对抵抗巨噬细胞杀伤具有部分冗余功能，且Wss1起主导作用。

Introduction
随着免疫缺陷人群扩大和抗真菌耐药性加剧，真菌感染已成为全球健康威胁。白色念珠菌作为WHO重点病原体，其逃逸宿主免疫的关键在于抵抗吞噬细胞产生活性氧（ROS）的能力。ROS会诱导多种DNA损伤，其中DPCs因阻碍DNA解旋酶和聚合酶功能而极具毒性。尽管酿酒酵母中Wss1和Ddi1已被证实参与DPC修复，但它们在氧化应激下的作用及其在白色念珠菌致病性中的意义尚未阐明。

Results
氧化应激诱导DPCs形成
实验显示，H₂O₂、NaOCl及醌类化合物甲萘醌（MD）、铅皂素（PB）处理15分钟后，两种真菌的DPCs水平显著升高，且与菌株存活率下降正相关。NaOCl处理时，DPCs增幅最高达5倍，暗示次氯酸可能通过形成组蛋白-DNA交联物发挥强烈损伤作用。

蛋白酶的双重防护机制
在酿酒酵母中，wss1? ddi1?双缺失株对所有氧化剂均表现超敏性，DPCs积累最显著。有趣的是，白色念珠菌wss1^-/-单缺失株即表现出严重生长缺陷，而ddi1^-/-表型与野生型相近，提示Wss1在病原菌中作用更突出。结构功能分析揭示，CaWss1催化位点突变体（E110Q）完全丧失功能，而VIM（Cdc48结合）和双SIM（SUMO结合）突变仅部分削弱活性，表明其通过多模块协同发挥作用。

巨噬细胞战场中的生存博弈
与体外实验结果呼应，白色念珠菌wss1^-/-/ddi1^-/-和wss1^E110Q/E110Q突变体在RAW264.7巨噬细胞共培养中存活率骤降60%，菌落尺寸显著缩小。这证实DPC修复系统是病原菌突破宿主第一道免疫防线的关键武器。

Discussion
研究首次将氧化应激-DPCs-蛋白酶修复轴与白色念珠菌致病性直接关联。不同于人类SPRTN依赖泛素化信号，真菌Wss1通过SUMO化途径识别底物，这种差异为开发特异性抗真菌药物提供了可能。值得注意的是，虽然TC-NER和PARP1等新修复路径近期在其他物种中被发现，但本研究表明在真菌中Wss1/Ddi1仍是抵抗氧化损伤的核心防线。

Materials and methods
技术亮点包括：采用瞬时CRISPR-Cas9系统构建白色念珠菌多重突变体；通过MTT法量化巨噬细胞杀伤效率；结合YEASTRACT数据库预测启动子转录因子结合位点。所有实验均设置三次生物学重复，统计学分析采用ANOVA或Kruskal-Wallis检验。

这项研究不仅深化了对真菌DNA损伤修复机制的理解，更开辟了通过靶向DPC修复蛋白酶对抗侵袭性真菌感染的新思路。未来研究可进一步探索Wss1/Ddi1抑制剂与现有抗真菌药物的协同效应，以及不同氧化应激源诱导DPCs的分子特征差异。