基于泊松分布模型的液滴单细胞测序中隐匿多重态概率研究及其在样本多重分析中的应用

研究人员针对液滴单细胞RNA测序(scRNA-seq)样本多重分析(mx-scRNA-seq)中隐匿多重态(stealth multiplets)的检测难题，通过建立泊松分布模型量化了均质隐匿、部分隐匿、多标记及未标记四类多重态的发生概率，实验验证了部分隐匿多重态在寡核苷酸条形码和SNP分型数据集中的存在，为优化标记策略和分型算法提供了理论依据，发表于《BMC Genomics》。

　　

在单细胞生物学领域，液滴微流控单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的出现彻底改变了细胞异质性研究的格局。然而，这项技术面临一个关键瓶颈——多重态(multiplets)问题，即单个液滴中意外捕获多个细胞的现象。传统解决方案如样本多重分析(mx-scRNA-seq)虽能通过样本特异性标记减少可检测多重态，但隐藏的"隐匿多重态"仍威胁数据可靠性。

欧洲分子生物学实验室巴塞罗那分部(EMBL Barcelona)的Fumio Nakaki和James Sharpe团队在《BMC Genomics》发表的研究，首次系统量化了四类多重态的发生规律。研究创新性地将隐匿多重态细分为均质隐匿(homogeneous stealth，同样本未检出多重态)和部分隐匿(partial stealth，标记与未标记细胞混合)，通过建立泊松分布-组合数学模型，揭示了标记效率(ai)和细胞负载参数(λ)对各类多重态比例的调控作用。实验验证显示，在标记效率90%、λ=0.3条件下，部分隐匿多重态占比可达3.2%，且在SNP分型数据中同样存在。

关键技术方法包括：(1)建立基于泊松分布的数学模型预测四类多重态概率；(2)采用3' CellPlex和MULTI-seq两种寡核苷酸标记系统构建小鼠3T3/胚胎干细胞混合样本；(3)整合GMM-demux、deMULTIplex2等算法评估分型效果；(4)应用UMAP降维和转录组评分系统验证隐匿多重态；(5)对CITE-seq和NSCLC临床数据集进行SNP分型与标记分型的对比分析。

研究结果

理论模型揭示隐匿多重态规律

通过推导得出四类多重态概率公式：均质隐匿(p_HS)=e^-λ(∑e^r_ia_iλ-āλ-s)，部分隐匿(p_PS)与标记效率呈负相关。当标记效率<90%时，部分隐匿多重态比例超过多标记类型(图1C)。增加样本数可降低均质隐匿风险，但部分隐匿因跨样本未标记细胞组合而持续存在(图1D)。

实验验证隐匿多重态存在

在3T3/ES细胞混合实验中，GMM-demux分型显示2.8%的多重态被误判为单细胞(图2D)，与理论预测2.81%高度吻合。标记效率不足时(如ES细胞条形码信号弱)，保守分型阈值会加剧误判(图2C)。而标记效率>99%的三样本(MULTI-seq)实验仅检出0.07%部分隐匿多重态(图2H)，证实优化标记可有效控制风险。

SNP分型存在多重态低估

在PBMC CITE-seq数据中，demuxalot算法仅检测到10%多重态，显著低于HTO分型的15%和理论期望值20%(图3B-C)。临床NSCLC数据集分析显示，15%的SNP分型"单细胞"实际为多重态(图4C)。测序深度降低会模拟低标记效率效应，使单细胞比例从96%(全读数)降至85%(50%读数)(图3D)。

算法比较与局限性

Scrublet等原位双态检测器对异源细胞多重态(如3T3/ES)识别率达85%，但对同源细胞(如PBMC不同供体)仅能识别32-39%部分隐匿多重态(补充图8)，证实其不适用于相似样本的多重分析。

结论与意义

该研究首次建立mx-scRNA-seq中四类多重态的定量预测框架，揭示部分隐匿多重态这一被忽视的误差来源。关键发现包括：(1)标记效率需>90%以控制部分隐匿风险；(2)SNP分型易低估多重态比例；(3)算法选择需匹配数据特征，保守分型会加剧误差。这些结论为设计大规模多重实验提供了关键参数指导，特别是对临床样本队列研究，强调需同步优化湿实验标记与干实验分型策略。研究建立的真实单细胞比率(TSR)计算公式，将成为评估mx-scRNA-seq数据质量的新标准。