高效稳定绵羊胚胎干细胞系的建立为农业和生物医学应用开辟新途径

研究人员针对绵羊胚胎干细胞(ESC)体外稳定建系难题，开发了基于IWR-1抑制剂的TePR培养体系，成功获得具有三胚层分化能力的TePR-sESCs。通过多组学分析揭示其转录组特征与8细胞期/桑椹胚相似，ATAC-seq和WGBS证实多能性位点存在开放染色质和低甲基化特征。该研究突破反刍动物干细胞研究瓶颈，为家畜性状工程和人类疾病模型构建提供新工具。

　　

在生物医学和农业领域，胚胎干细胞（ESC）因其无限自我更新能力和多向分化潜能，被视为疾病建模、药物筛选和家畜育种的革命性工具。尽管小鼠、人类乃至猪和牛的ESC研究已取得显著进展，但绵羊作为重要的农业畜种和人类疾病模型（其心血管系统与人类高度相似，适用于心肌梗死等疾病研究），其稳定ESC系的建立始终面临挑战。传统培养体系存在成分复杂、建系效率低等问题，严重制约了绵羊在转基因育种和生物医学研究中的应用。

针对这一科学瓶颈，西北农林科技大学的研究团队在《Journal of Advanced Research》发表创新成果。研究人员通过优化培养体系，仅需在mTeSR PLUS基础培养基中添加WNT/TNK抑制剂IWR-1（命名为TePR条件），即可高效获得能长期传代（>100代）的绵羊ESC（TePR-sESCs）。研究整合Smart-seq2胚胎转录组测序、ATAC-seq染色质可及性分析和全基因组甲基化测序（WGBS）等多组学技术，结合CRISPR/Cas9基因编辑和嵌合体实验，系统评估了该细胞系的生物学特性。

关键技术包括：（1）采用体内受精囊胚建立ESC系；（2）通过碱性磷酸酶染色、核型分析和三胚层分化实验验证多能性；（3）利用PiggyBac转座子系统进行mCherry标记；（4）对胚胎不同发育阶段（E0-E6）进行转录组图谱构建；（5）采用ATAC-seq和WGBS解析表观遗传特征。

TePR培养基支持绵羊ESC系的衍生和稳定长期培养
研究团队比较四种培养体系后发现，TePR条件下的建系效率达57%，显著高于其他条件。获得的TePR-sESCs保持正常二倍体核型（2n=54），表达POU5F1、SOX2等核心多能性因子，体外能分化为外胚层（NESTIN⁺）、中胚层（ACTA2⁺）和内胚层（FOXA2⁺）细胞，体内可形成包含三胚层组织的畸胎瘤。

TePR-sESCs的转录特征
转录组分析显示，绵羊胚胎基因组激活（EGA）发生在8细胞期至桑椹胚阶段。TePR-sESCs的基因表达模式与8细胞期/桑椹胚高度相似，差异表达基因（DEG）富集于WNT和BMP信号通路。值得注意的是，多能性基因POU5F1在桑椹胚中表达最高，而DPPA4在8细胞期与ESC中表达量相当。

表观遗传特征解析
ATAC-seq揭示TePR-sESCs染色质开放区域富集POU5F1、SOX2等转录因子结合 motif。WGBS显示其整体甲基化水平达82%，但多能性相关区域呈现低甲基化状态，与人类和猪EPSCs特征一致。联合分析发现13个关键调控基因（如SIX6、MECOM），这些基因同时存在差异甲基化区域（DMR）、差异染色质可及性区域（DAR）和差异表达。

WNT信号通路维持多能性
撤除IWR-1会导致细胞分化，而用XAV939替代仍可维持多能性，证实Tankyrase抑制剂通过调控β-catenin稳定性维持干细胞状态。研究还成功利用PiggyBac转座子实现mCherry标记，并通过CRISPR/Cas9敲除肌肉生长抑制素基因（MSTN），获得编辑效率达97.4%的纯合突变株。

该研究首次建立了可长期传代的绵羊ESC系，其转录组和表观组特征为理解反刍动物早期发育提供了新视角。TePR体系的简化设计（仅需添加单一小分子抑制剂）显著提升了实验可重复性。尽管嵌合体实验尚未成功，但高效的基因编辑能力已为制备基因修饰家畜奠定基础。从转化医学角度看，这类细胞可用于构建人类退行性疾病（如骨关节炎）的大型动物模型，其生理尺度更接近临床实际。在农业领域，结合基因组编辑技术可快速培育抗病、高产绵羊新品种，为应对粮食安全挑战提供创新解决方案。