基于二维液相色谱技术的人体汗液乳酸对映体定量分析及其在无创生物标志物中的应用

本研究针对汗液中乳酸(LA)对映体检测灵敏度不足的问题，开发了基于NBD-PZ荧光标记和心脏切割二维液相色谱(2D-LC)的分析方法，实现了5μL微量汗液中D/L-LA的精准定量（D-LA: 30.29±20.18μM，L-LA: 23.69±12.15mM），为糖尿病等疾病的非侵入性诊断提供了新思路。

　　

在人体复杂的代谢网络中，乳酸(Lactate, LA)作为糖酵解的关键产物，其两种镜像分子——D型和L型对映体的平衡与多种疾病密切相关。传统血液检测虽能反映LA水平，但穿刺采样带来的不适和感染风险限制了其应用。汗液作为新兴的无创生物样本，含有丰富的代谢信息，然而汗液中D-LA浓度仅为L-LA的千分之一，这种巨大的浓度差使得传统分析方法难以精准捕捉D-LA的细微变化。更棘手的是，现有酶法检测存在交叉反应干扰，而色谱方法又面临灵敏度不足的瓶颈。

东京大学研究生院药学系（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo）的Kazushi Mori和Makoto Tsunoda团队突破技术壁垒，开发出基于心脏切割二维液相色谱(2D-LC)的创新检测方案。研究人员采用4-硝基-7-哌嗪基-2,1,3-苯并恶二唑(NBD-PZ)荧光标记技术，结合双柱分离策略：第一维ODS柱(十八烷基硅胶柱)去除汗液基质干扰，第二维CHIRALPAK IC手性柱实现D/L-LA基线分离。通过优化衍生化条件（40℃反应50分钟）和流动相组成（甲醇/乙腈=95/5），方法在1-100μM(D-LA)和10-1000μM(L-LA)范围内呈现优异线性(R2>0.999)，定量限分别达0.97μM和1.12μM。

关键技术包括：1）微型汗液采集系统（右食指3分钟采样结合左食指微汗传感器同步监测汗液速率）；2）减压干燥浓缩技术（5.6倍浓缩解决D-LA痕量检测难题）；3）双荧光检测器联用（激发/发射波长491/547nm）。研究纳入5名健康男性志愿者（22-30岁），每位采集4次重复样本确保数据可靠性。

研究结果揭示：

1. 衍生化优化：相较于传统2-3小时反应，40℃加热50分钟即可完成NBD-PZ标记，且高温（>40℃）会产生干扰杂质。
2. 色谱分离：第一维采用水/甲醇/乙腈(70/20/10)混合流动相，成功将NBD-PZ-LA保留时间控制在29-33.5分钟区间；第二维甲醇/乙腈(95/5)体系使对映体分离度达1.5以上。
3. 方法验证：加标回收率85.6%-100.4%，日内精密度1.04%-12.03%，满足生物样本分析要求。
4. 实际应用：测得健康人群汗液L/D-LA比值为952±297，显著低于既往肘部汗液研究结果（约3000），提示采样部位影响代谢物分布。

这项发表于《Journal of Chromatography Open》的研究具有双重突破意义：方法学上，首次将2D-LC技术应用于汗液对映体分析，解决了超低浓度D-LA检测的"大海捞针"难题；临床应用上，为糖尿病（与D-LA水平升高相关）和短肠综合征（D-LA代谢障碍）等疾病提供了便捷的无创监测窗口。未来研究可进一步探索汗液LA的昼夜节律、年龄性别差异，以及其与肠道菌群代谢的关联，推动个性化医疗发展。