基于TIMS-ddaPASEF技术的无标记鸟枪法蛋白质组学中MS/MS搜索算法比较研究：宿主细胞蛋白监测的新视角

本研究系统评估了Mascot、MaxQuant等6种MS/MS搜索工具在TIMS-ddaPASEF模式下对CHO细胞同位素标记蛋白的鉴定与定量性能，通过贝叶斯决策理论和HMC采样建立了兼顾准确性与不确定性的评估框架，为生物制药中HCP监测提供了工具选择依据。

　　

在生物制药领域，宿主细胞蛋白（HCP）作为重组治疗药物中的关键质量属性，其残留可能影响产品安全性和有效性。尽管无标记鸟枪法蛋白质组学（label-free shotgun proteomics）已成为HCP监测的重要手段，但不同串联质谱（MS/MS）搜索算法的性能差异直接影响检测深度和定量可靠性。目前，离子淌度（TIMS）与平行累积连续碎裂（ddaPASEF）等新技术虽提升了检测灵敏度，却缺乏系统的算法评估框架。

GSK（Rixensart, Belgium）的研究人员针对这一技术空白，开展了一项开创性研究。他们采用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）同位素标记蛋白的四浓度梯度样本，通过TIMS-ddaPASEF技术获取数据，并运用贝叶斯建模与哈密尔顿蒙特卡洛（HMC）采样，对Mascot、MaxQuant等6种主流MS/MS工具进行了多维性能评估。该研究发表于《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》，为生物制药行业提供了首个结合先进质谱技术与概率统计的算法选择指南。

关键技术方法包括：1）采用TIMS-ddaPASEF模式采集数据，设置8个PASEF斜坡和100-1350 m/z范围；2）构建含5280个C. griseus蛋白序列的数据库；3）应用Hi3定量策略和三种肽段聚合方法；4）通过隔离森林算法剔除异常值；5）采用贝叶斯框架计算后验概率分布，结合期望效用最大化进行决策分析。

研究结果方面：
3.1 标记CHO蛋白质组的鉴定性能
PEAKS展现出最优蛋白覆盖度（L4级1565个蛋白），Byos则实现最高肽段鉴定数（9486个）。单命中蛋白分析显示PEAKS达569个，而Byos仅181个，表明后者具有更可靠的蛋白推断能力。

3.2 定量精度与线性评估
FragPipe展现出最佳数据提取精度（中位CV% 10.9-12.6%），而MaxQuant波动最大（CV% 23.4-34.8%）。Bootstrapping线性回归显示Byos的R²达0.918，显著优于FragPipe（0.631）。

3.4 蛋白质水平差异分析
贝叶斯后验分布表明Byos、SpectroMine和Mascot的中位log2FC误差最低（0.12-0.21），PEAKS偏差最大（0.70）。效用函数分析进一步验证Byos（U=0.67）和SpectroMine（U=0.65）的综合性能优势。

3.5 HCP定量真实性
基于MassPREP标准品构建的剂量响应曲线显示，Byos在线性（R²=0.962）和真实性（平均绝对偏差8.9）上均领先，而MaxQuant偏差达21.3。

该研究创新性地建立了融合算法评估、统计建模与决策理论的综合分析框架。结论指出：Byos和SpectroMine在定量准确性上表现卓越，FragPipe擅长数据重现性，PEAKS适用于深度覆盖需求，而Mascot在测量真实性上表现突出。这些发现不仅解决了生物制药行业HCP监测的工具选择困境，更通过引入贝叶斯不确定性量化，为蛋白质组学数据分析提供了新的方法论范式。特别值得注意的是，研究揭示不同工具在肽段聚合方法（sum/median/avg）上的性能差异，这一发现对优化定量流程具有直接指导意义。