重组大肠杆菌全细胞表达Burkholderia sp.脂肪酶催化植物甾醇酯的酶法合成：一种高效生物催化新策略

本研究针对植物甾醇酯酶法合成中脂肪酶稀缺的关键问题，通过构建重组E. coli Origami 2(DE3)高效表达Burkholderia sp. LipA脂肪酶系统。研究发现该脂肪酶对p-硝基苯癸酸酯水解活性达10669.6 nKat/mg，在n-己烷/[EMIM]Tf2N体系中成功催化豆甾醇月桂酸酯合成（转化率90.3%）。该成果为植物甾醇酯工业化生产提供了新型全细胞生物催化剂。

　　

植物甾醇作为植物油籽中的重要活性成分，具有降低血清胆固醇、抗炎抗癌等显著健康效益。然而这些"植物黄金"存在两大应用瓶颈：一是油溶性差，在食品中多以晶体粉末形式存在；二是人体肠道吸收率不足5%，远低于胆固醇的35%-70%。传统解决方案是通过C-3位羟基与长链脂肪酸酯化来改善性能，但现有微生物脂肪酶对植物甾醇酯的催化活性普遍低下。

针对这一技术难题，国内某研究机构的研究团队创新性地开发了基于Burkholderia sp.脂肪酶LipA的重组大肠杆菌全细胞催化系统。通过优化基因排列顺序（lipB-lipA）、选用Origami 2(DE3)宿主和20℃低温培养，使可溶性表达量提升至1676.7 nKat/OD₆₀₀。研究发现该脂肪酶更符合EC 3.1.1.3标准而非胆固醇酯酶，在n-己烷/离子液体混合体系中展现出卓越的催化性能，相关成果发表在食品科技领域权威期刊《LWT》上。

研究采用的主要技术包括：重组质粒pETDuet-B1A2构建、HisTrap HP亲和层析纯化、sol-gel包埋固定化技术、气相色谱分析（GC-FID）、分子动力学模拟（AMBER 18）和AutoDock分子对接等。其中创新性地将全细胞固定化技术与离子液体介质相结合，解决了底物跨膜传输的难题。

【高水平的LipA可溶性表达】通过系统优化基因排列（lipB优先）、选用促进二硫键形成的Origami 2宿主和20℃低温培养，使可溶性表达量较常规BL21宿主提升7.9倍。SDS-PAGE显示纯化蛋白分子量约34kDa，与天然酶一致。

【独特的酶学特性】LipA最适pH8.0、温度40℃，对中链脂肪酸酯（C10-C12）表现出显著偏好，p-硝基苯癸酸酯水解活性达10669.6 nKat/mg。金属离子实验表明Mg²⁺有激活作用而Fe²⁺/Zn²⁺/Cu²⁺抑制活性。

【创新的反应体系】在n-己烷/[EMIM]Tf₂N（1:1）二元体系中，固定化全细胞催化豆甾醇与月桂酸的酯化反应，24小时转化率达87.7%。分子模拟显示界面效应显著改变了酶活性口袋构象。

【动力学特征】豆甾醇月桂酸酯合成呈现线性动力学特征，初始速率0.15 μmol·mg^-1·h^-1，36小时转化率突破90%。相比之下，苯乙醇与乙酸酐的酯化反应速率高达107.85 μmol·mg^-1·h^-1，4小时即完成96.9%转化。

该研究首次证实Burkholderia sp. LipA更适合归类为经典脂肪酶（EC 3.1.1.3）而非胆固醇酯酶，其全细胞催化系统突破了植物甾醇酯合成的效率瓶颈。通过离子液体介质优化和分子对接指导，阐明了月桂酸与LipA活性中心His⁸⁶/Gly¹⁶/Tyr²⁹形成三重氢键的关键机制。虽然当前催化速率仍需提升，但该工作为开发新型植物甾醇衍生物提供了技术范式，在功能性食品和医药领域具有重要应用前景。未来通过蛋白质工程改造活性中心、开发更稳定的离子液体介质，有望进一步推动该技术的工业化进程。