生物催化有氧氧化大规模制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的酶工程与工艺开发

研究人员针对非活化C(sp3)–H键直接羟基化的合成难题，开发了基于Fe(II)/α-KG依赖型加氧酶的生物催化体系，实现了L-脯氨酸到trans-3-羟基-L-脯氨酸（PCSK9抑制剂MK-0616关键中间体）的公斤级制备（>400 kg），该工艺整合酶定向进化与原位保护策略，为工业化生产提供了绿色高效解决方案。

　　

在药物合成领域，非活化C–H键的直接立体选择性羟基化一直是有机化学的"圣杯反应"。传统化学方法往往需要多步保护和苛刻条件，而trans-3-羟基-L-脯氨酸作为新型降胆固醇药物PCSK9（前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型）抑制剂enlicitide decanoate（MK-0616）的关键砌块，其工业化生产面临巨大挑战。

研究人员通过创新性地开发Fe(II)和α-酮戊二酸（α-KG）依赖型加氧酶的生物催化体系，实现了L-脯氨酸C3位点的高效羟基化。该研究采用"酶发现-蛋白质工程-工艺开发"三位一体策略：首先筛选天然羟基化酶，随后通过理性设计和定向进化优化酶活性；最终建立包含原位N-苄氧羰基（Cbz）保护和结晶纯化的集成工艺。关键技术包括：1）高通量酶筛选系统；2）蛋白质工程技术（如定点突变）；3）克级反应器优化工艺参数；4）原位保护-分离耦合技术。

【酶工程改造】
通过结构引导的蛋白质工程，将天然酶的催化效率（k_cat/K_M）提升300倍，实现在200 g/L底物浓度下仅需0.5 mol%酶负载量。晶体结构分析显示，活性中心第158位苏氨酸突变为丙氨酸（T158A）显著提高了氧结合能力。

【工艺放大】
开发的两相反应体系（水相反应/有机相萃取）有效解决了底物溶解性和产物抑制问题。在50 L反应器中连续运行10批次后，酶活性仍保持初始的92%，证实了工艺稳定性。

【产物纯化】
创新的pH调控结晶法使N-Cbz保护产物5的纯度达到>99.5%，单次结晶收率85%，较传统柱层析法减少60%有机溶剂用量。

该研究首次实现了非活化脂肪族C–H键羟基化的工业化应用，为MK-0616等药物的大规模生产奠定基础。其意义在于：1）建立生物催化C–H键功能化新范式；2）证实工程化Fe(II)/α-KG酶在连续生产中的稳定性；3）开发的高浓度底物反应体系（较文献报道提高20倍）显著降低生产成本。相关成果发表于《Organic Process Research》，为绿色制药工艺提供了标杆案例。