基于分子信标辅助滚环扩增的通用荧光侧流层析技术用于核酸即时检测

为解决核酸即时检测(POCT)在资源有限环境中的应用难题，研究人员开发了一种结合分子信标(MB)辅助滚环扩增(RCA)与荧光侧流层析(F-LFS)的新型检测技术RCA-F-LFS。该技术以肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)为靶标，实现了0.1 pM的高灵敏度检测，临床样本检测结果与现行方法100%吻合。其创新性在于通过简单更换靶序列即可检测其他核酸目标，为临床POCT提供了通用、灵敏且特异的解决方案。

　　

在临床诊断领域，特别是资源匮乏地区，如何实现高灵敏度、低成本的核酸即时检测(POCT)一直是重大挑战。传统实时聚合酶链反应(RT-PCR)虽为金标准，但其依赖精密仪器和专业实验室的特性限制了基层应用。而现有侧流层析技术又面临灵敏度不足导致的假阴性问题。针对这一技术瓶颈，来自郑州儿童医院/河南省儿童医院（Henan Children's Hospital Zhengzhou Children's Hospital）的研究团队在《Sensors and Actuators Reports》发表了一项突破性研究。

研究人员创新性地将分子信标(Molecular Beacon, MB)辅助的滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)技术与荧光侧流层析(Fluorescent Lateral Flow Strips, F-LFS)相结合，开发出名为RCA-F-LFS的新型检测平台。该技术通过三个关键创新：采用单引物启动的RCA实现等温扩增，利用MB实现单碱基分辨率特异性，结合F-LFS实现可视化检测。研究以导致儿童社区获得性肺炎的主要病原体——肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)为模型，验证了该技术的临床应用价值。

【关键技术方法】
研究团队首先优化了MB辅助RCA体系，采用Phi29 DNA聚合酶在34°C恒温下扩增，通过BmgBI限制性内切酶切割产生荧光信号片段。临床样本来自30例强阳性和30例弱阳性咽拭子，经Tiangen Biotech试剂盒提取核酸后，使用自制的硝酸纤维素膜HF135构建F-LFS检测系统，通过荧光免疫分析仪定量信号。

【研究结果】
3.1 设计原理
RCA-F-LFS包含两个核心模块：MB辅助RCA产生含荧光素(FAM)标记的短片段，F-LFS通过T线捕获探针实现可视化检测。C线作为质控线确保检测有效性，这种设计使系统具备检测多种核酸靶标的扩展能力。

3.2 可行性验证
实时荧光曲线显示，10 nM肺炎支原体DNA在60分钟内信号达到平台期，而阴性对照无扩增。琼脂糖凝胶电泳证实0.1 nM靶标即可有效扩增，BmgBI成功将产物切割为小片段。对RNA的检测同样有效，证明技术适用于不同核酸类型。

3.3 参数优化
系统测试表明：60分钟扩增时间、34°C反应温度、20U BmgBI用量和60μL上样量为最优条件。值得注意的是，MB的熔解温度(T_m)32.5°C与最佳反应温度34°C的高度匹配，确保了检测特异性。

3.4 灵敏度与特异性
在0.1 pM-0.1 nM范围内，T/C比值与靶标浓度对数呈线性相关(R²=0.98475)。对140例含肺炎链球菌(SP)、腺病毒(ADV)等病原体的临床样本检测显示，系统仅对肺炎支原体产生信号，证明其单碱基分辨能力。

3.5 临床验证
60例临床咽拭子(30强阳性/30弱阳性)检测显示，强阳性组T/C比值显著高于弱阳性组(P<0.01)，与RT-PCR结果完全一致。高温高湿(37°C, 80%湿度)加速试验证实系统具有12天的储存稳定性。

【结论与意义】
该研究建立的RCA-F-LFS技术突破了传统POCT的灵敏度瓶颈，其0.1 pM的检测限已接近RT-PCR水平。通过"更换靶序列"的模块化设计理念，为其他传染病核酸检测提供了技术范式。特别值得注意的是，系统对肺炎支原体RNA的检测能力，使其能够监测病原体活性状态，这对指导抗生素使用具有重要临床价值。研究团队Xiaopeng Chen、Wentao Wang等提出的这种整合等温扩增与荧光检测的策略，为资源有限地区实现精准医疗提供了切实可行的解决方案。