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本文聚焦固相寡核苷酸合成中胞苷和 5 - 甲基胞苷的酸介导脱氨，分析水分、保护基、糖修饰等影响因素，发现乙酰保护更抗脱氨、5 - 甲基胞苷更易脱氨，为减少杂质、保障序列完整性提供关键依据。
2. Introduction
近年来，寡核苷酸疗法的发展推动了核酸化学研究，近 20 种反义寡核苷酸（ASOs）和小干扰 RNA（siRNAs）药物已获批商业化，它们主要通过基于亚磷酰胺化学的固相合成法制备。该方法通过四步循环反应合成寡核苷酸：1）用强酸溶液（如三氯乙酸、二氯乙酸）去除二甲氧基三苯甲基（DMTr）基团；2）游离的 5'- 羟基与 3' 位含亚磷酰胺功能的核苷偶联；3）三价磷原子氧化或硫化；4）未反应的 5'- 羟基乙酰化（即封端过程）。
固相合成的寡核苷酸经纯化后仍含特有杂质，如短链杂质和硫代磷酸酯（PS）/ 磷酸酯（PO）取代产物，因结构和理化性质相似难以去除，故需控制合成中杂质生成。含 2'-O - 甲基 - RNA（2'-OMe）、2'-O - 甲氧基甲基 - RNA（2'-MOE）等糖修饰的人工寡核苷酸及锁核酸（LNA）可增强结合能力和稳定性，5 - 甲基胞嘧啶修饰能抑制免疫刺激。但合成中需关注化学修饰寡核苷酸的特有杂质，如胞苷和 5 - 甲基胞苷脱氨产生的尿苷和胸苷，这会影响药物功能，因此需研究固相合成中这类脱氨反应。
3. Results and Discussion
2.1. Deamination reaction during solid-phase synthesis
研究固相合成中寡核苷酸的脱氨，用负载在聚苯乙烯载体上的五聚体寡核苷酸 ON1（5' 端含 5 - 甲基胞苷 - LNA 修饰），经 15% 二氯乙酸（DCA）的甲苯或乙腈溶液处理不同时间。HPLC 和 LC/MS 分析显示 5 - 甲基胞嘧啶部分转化为胸腺嘧啶，转化率随时间增加，且两种溶剂初期转化率相近，24 小时时乙腈体系略高，表明固相合成中脱氨依赖反应时间，溶剂对动力学影响不大。
2.2. Effects of the presence of water in the solvent
脱氨机制为胞苷 N3 位质子化后 C4 位加水。实验用含不同水分（0.003–15%）的 3% 和 15% DCA 乙腈溶液处理载体上的寡核苷酸 24 小时，结果显示胸腺嘧啶转化率强烈依赖水分和 DCA 浓度。水分 0.003% 时转化率低，15% 水分的 15% DCA 溶液中 ON1 的 5 - 甲基胞苷 - LNA 转化率达 83.5%，表明水分加速脱氨。
2.3. Effects of the modification position of 5-methylcytosine
用三种寡核苷酸 ON1–3（5 - 甲基胞苷 - LNA 插入位置不同），经含 1.5% 水的 15% DCA 乙腈溶液处理，T/mC 比值分别为 21.2%、27.4%、25.2%，表明脱氨程度与 5 - 甲基胞苷 - LNA 插入位置无关。
2.4. Effect of protecting groups on the 5'-OH group of oligonucleotides
去除 ON1 的 5'-O-DMTr 基团后，用不同当量乙酰封端试剂处理，再经含 1.5% 水的 15% DCA 乙腈溶液处理 24 小时，脱氨率为 23–25%，与有无乙酰化及当量无关，且与带 DMTr 基团的 ON1 结果差异小，表明 5'- 端保护基不影响 5 - 甲基胞苷 - LNA 的酸介导脱氨。
2.5. Effects of sugar moiety structure
为验证结果并非 LNA 特有，研究 2'-OMe、2'-MOE 修饰的 RNA 衍生物及 DNA 中 5 - 甲基胞苷的脱氨。ON4–6（含 Bz 保护的 5 - 甲基胞苷 - 2'-OMe、2'-MOE 及 DNA）经不同条件处理，在 15% 水分的 15% DCA 溶液中转化率超 90%，与 ON1 的 T/mC 比值相近，表明脱氨与糖基化学修饰无关。
2.6. Effects of methyl group at C5-position
ON7（含苯甲酰保护胞苷）经处理后生成尿苷，但转化率仅约 5%，远低于苯甲酰 - 5 - 甲基胞苷（ON6 为 95.3%）。因 5 - 甲基的给电子效应增加 N3 碱性，使 5 - 甲基胞苷比胞苷更易脱氨，与 DNA 中的现象一致。
2.7. Effects of protecting groups at N4-position
ON8（含 N4 - 乙酰 - 2'- 脱氧 - 5 - 甲基胞苷）和 ON9（含 N4 - 乙酰 - 2'- 脱氧胞苷）经处理，脱氨产物生成率低于苯甲酰保护的 ON6 和 ON7。15% 水分的 15% DCA 溶液中，ON8 转化率约 20%，远低于 ON6 的 90%。因苯甲酰胺酸性更强、离去能力更好，且吸电子能力强于乙酰基，故苯甲酰保护加速脱氨。
2.8. Acid-mediated deamination of cytosines in solid-phase oligonucleotide synthesis assumed from the results of this study
固相合成中会产生 5 - 甲基胞苷脱氨产物，5 - 甲基胞苷比胞苷易脱氨，脱氨与糖基结构无关，氨基保护基从苯甲酰换为乙酰可显著抑制脱氨。溶剂水分影响大，15% 水分的 15% DCA 溶液中 80% 以上苯甲酰 - 5 - 甲基胞苷转化为胸腺嘧啶。常规 anhydrous 条件下脱氨率低，但水分≥1.5% 会加剧脱氨。因脱氨杂质与目标产物结构相似难分离，需抑制胞苷脱氨，本研究结果有助于实现这一目标。
3. Conclusion
研究固相合成中 detritylation 过程的胞嘧啶和 5 - 甲基胞嘧啶脱氨，发现液相合成中的脱氨在固相合成中也存在。酸性条件下脱氨有五大趋势：1）与 5 - 甲基胞苷位置无关；2）水分加速脱氨；3）不受糖基修饰影响；4）乙酰保护胞嘧啶比苯甲酰保护更不易脱氨；5）5 - 甲基胞苷比胞苷更易脱氨。常规 anhydrous 条件下脱氨及杂质少，但少量水分会使脱氨加剧。鉴于杂质与目标产物结构相似，控制其比例对保障寡核苷酸质量至关重要，本研究结果有助于消除脱氨产物，获得序列完整的目标产物。
4. Materials and methods
4.1. General
所用试剂购自不同公司，用 AKTA Oligopilot100 自动合成仪合成寡核苷酸，采用 SHIMADZU LCMS-8045 进行液质联用（LC/MS）分析，HPLC 采用两种方法，分别使用不同仪器和色谱柱。
4.2. Synthesis of oligonucleotides
将 LNA - 苯甲酰 - 5 - 甲基胞苷亚磷酰胺溶于无水乙腈 / 二氯甲烷，其他亚磷酰胺溶于无水乙腈。以 Primer Support 5G UnyLinker350 为固相载体，按约 260μmol 规模合成寡核苷酸，使用特定试剂作为活化剂、脱保护试剂、氧化剂和封端试剂，合成的寡核苷酸在三苯甲基保留模式下干燥。
4.3. Reactions in acidic conditions
制备含不同水分的 3–15% DCA 乙腈或甲苯溶液，按比例与负载寡核苷酸的载体反应，搅拌后过滤、洗涤，加浓氨水 cleavage 并脱保护，浓缩冻干后溶解，用反相 HPLC 和 LC/MS 分析。
4.4. Preparation of acetyl-capped oligonucleotides on solid-support
用 3% DCA 乙腈溶液去除 ON1 的 5'-O-DMTr 基团，洗涤后分成三等份，用不同当量乙酰封端试剂处理，反应后过滤洗涤，直接用于脱氨研究。
