血友病A患者F8基因变异谱分析：18种新发变异的鉴定与功能验证

本研究针对血友病A（HA）基因诊断的临床需求，通过多技术联合检测（IS-PCR/Sanger/WES/MLPA）对123例患者开展F8基因变异分析，发现55例Int22倒位、18种新变异，并通过RT-PCR实验验证c.144-26A>C和c.6116-1G>C的致病机制，为基因诊断与遗传咨询提供重要依据。

　　

血友病A作为一种X连锁隐性出血性疾病，其发病机制与凝血因子VIII（FVIII）编码基因F8的变异密切相关。尽管目前人类基因突变数据库（HGMD）已收录4434种F8变异，但临床仍存在大量变异致病性不明、基因型与表型关联不清等问题。尤其值得注意的是，约40-50%的重型患者由内含子22倒位（Int22）引起，但剩余病例的遗传基础仍有待系统解析。

为完善中国人群F8变异谱系，湖南家辉遗传医院的研究团队对115个家系的123例HA患者展开深入研究。通过整合反向序列PCR（IS-PCR）、桑格测序、全外显子测序（WES）和多重连接探针扩增（MLPA）等技术，系统鉴定了包括倒位、错义变异、无义变异等七大类变异类型。研究特别采用逆转录PCR（RT-PCR）对剪接位点变异进行功能验证，发现c.144-26A>C变异可通过产生截短转录本导致FVIII表达不足，而c.6116-1G>C则通过创建新剪接受体引发移码突变。

关键技术方法包括：1）IS-PCR检测Int22/Int1倒位；2）WES与Sanger测序鉴定单核苷酸变异和小片段插入缺失；3）MLPA分析大片段变异；4）RT-PCR验证剪接模式改变。研究对象来自2010-2023年湖南家辉遗传医院收治的患者队列，涵盖重型（81例）、中型（32例）和轻型（6例）HA。

主要研究结果：

1. 变异谱特征：55例（44.7%）检出Int22倒位，28例（22.8%）为错义变异，18例（14.6%）为小片段插入缺失，发现18种国际未报道的新变异。
2. 临床关联：抑制剂发生率（11.4%）显著高于中国人群基线数据（3.9%），大片段缺失和无义变异患者更易产生抑制剂。
3. 功能验证：c.144-26A>C变异产生两种截短转录本，解释轻型HA表型；c.6116-1G>C导致外显子跳跃引发重型HA。
4. 携带者检测：发现2例患者母亲存在生殖腺嵌合现象。

该研究通过扩大样本量和实验验证，将多个临床意义未明变异（VUS）升级为可能致病（LP），显著完善了F8变异数据库。特别是对剪接变异的分子机制解析，为精准诊断提供了直接证据。研究获得国家重点研发计划（2021YFC1005300）、国家自然科学基金（82171711）等项目支持，相关成果发表于《Thrombosis Research》。这些发现不仅深化了对HA基因型-表型关系的理解，更为临床遗传咨询和个体化治疗决策提供了重要依据。