"Arrest Peptide Profiling"技术揭示活细胞内共翻译折叠路径与分子伴侣互作机制

本研究通过开发高通量"Arrest Peptide Profiling"(AP Profiling)技术，解决了活细胞内共翻译折叠过程难以检测的难题。研究人员以GTP酶结构域为模型，解析了拓扑结构如何决定折叠路径，并通过基因敲除实验揭示了触发因子(TF)和DnaK分子伴侣的功能冗余机制。该技术为系统研究新生蛋白质折叠提供了高分辨率平台，论文发表于《Nature Communications》。

　　

蛋白质折叠是生命科学的核心谜题之一，而共翻译折叠（co-translational folding）作为蛋白质合成的关键步骤，其动态过程长期以来如同"黑箱"。当新生肽链从核糖体出口隧道逐渐延伸时，如何在拥挤的细胞环境中避免错误折叠？分子伴侣如何精确指导这一过程？这些问题的答案对理解蛋白质稳态维持至关重要。传统体外研究方法难以模拟细胞内复杂环境，而现有活体检测技术又面临通量低、分辨率不足的瓶颈。

约翰霍普金斯大学医学院的研究团队在《Nature Communications》发表突破性研究，开发出名为"Arrest Peptide Profiling"(AP Profiling)的高通量技术。该技术巧妙利用SecM停滞肽(AP)的力敏感特性，结合流式细胞分选和深度测序，首次实现了活细胞内共翻译折叠过程的密码子级分辨率检测。研究人员通过对EF-G和EF-Tu等GTP酶结构域的系统分析，发现拓扑结构差异会引导截然不同的折叠路径。更引人注目的是，通过基因敲除实验揭示了触发因子(TF)和DnaK这两种分子伴侣通过作用于新生链不同位点实现功能冗余的分子机制。

关键技术方法包括：1）设计双报告基因系统（msGFP/mCherry）实现定量检测；2）构建时间依赖性核酸外切酶消化的截短文库；3）流式细胞分选结合"sort-seq"测序方案；4）单分子光学镊子验证关键构象状态；5）在△tig和△dnaKJ菌株中进行遗传学分析。

【Ratiometric fluorescence measurements report on co-translational folding in live cells】
通过将SecM AP与超折叠GFP(msGFP)报告系统耦合，建立双荧光(mCherry内参)检测平台。实验证实完全挤出的GEF-G结构域(n_codons=331)比部分合成片段(n_codons=212)荧光强度高100倍，而AP缺陷突变体(AP_mut)信号再增强10倍，确立了三数量级的动态范围。

【AP Profiling quantifies co-translational folding with codon resolution】
采用外切酶消化构建截短文库，通过12级分选门定量获得"AP分数"。发现GEF-G在n_codons≈330处出现显著折叠峰，苯丙氨酸-丙氨酸突变体(F/A)验证该信号源于三级结构形成。单分子光学镊子显示野生型GEF-G存在特征性解折叠"撕裂"，而F/A突变体曲线平滑，证实AP Profiling可特异性检测稳定三级结构。

【AP Profiling resolves a co-translational folding intermediate】
GEF-Tu分析发现两个明显折叠峰：n_codons≈198(中间体)和n_codons≈242(完整结构)。单分子实验捕捉到部分解折叠中间态(增加23.1±1.2 nm轮廓长度)，对应N端140个氨基酸形成的核心P-loop片段。结构比对揭示GEF-Tu缺乏GEF-G的G'插入域，导致二者折叠路径差异。

【Functional redundancy of chaperone function in co-translational folding】
在△tig和△dnaKJ菌株中，GEF-Tu的AP分数变化集中在n_codons≈200区域，但精确位点不同：TF主要影响h7-s6区域，DnaK作用于相邻片段。这种空间邻近但精确位点分离的作用模式，解释了非同源分子伴侣如何实现功能冗余。

【AP Profiling for co-translational multi-domain protein folding】
全长EF-G分析显示G结构域(n_codons≈330)和II结构域(n_codons≈437)存在共翻译折叠信号，而EF4的III结构域在TF缺失时表现出独特的"先抑制后增强"模式，提示分子伴侣可能通过调节折叠协同性发挥作用。

这项研究建立了首个能在活细胞环境中系统解析共翻译折叠的技术平台，其创新性体现在三个方面：首先，AP Profiling突破了传统方法在通量和分辨率上的限制，实现了从单个结构域到多结构域蛋白质的全尺度分析；其次，发现拓扑结构微小的差异（如G'插入域）可导致折叠路径显著分歧，为理解蛋白质进化提供了新视角；最后，阐明分子伴侣通过空间精确定位实现功能冗余的机制，为靶向蛋白质稳态网络的药物设计奠定基础。该技术未来可拓展至膜蛋白插入等研究领域，为全面揭示蛋白质生物发生规律提供强大工具。