Rap1通过限制Ku蛋白内移保护端粒末端免受非同源末端连接修复的分子机制

本研究揭示了酵母端粒保护的新机制：Rap1蛋白通过直接抑制Ku70-Ku80异源二聚体（Ku）在DNA上的内移（inward translocation），阻止其激活非同源末端连接（NHEJ）通路。研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Rap1-DNA-Ku三元复合物结构，结合纳米孔测序和遗传学实验，证明单个Rap1分子即可通过空间位阻效应限制Ku的功能转换，从促修复因子转变为端粒保护因子。该发现解决了Ku蛋白在端粒区"既存在又不引发NHEJ"的悖论，为理解基因组稳定性维持提供了新视角。

　　

染色体末端如何避免被误认为DNA断裂而触发修复机制，一直是分子生物学领域的核心问题。尽管已知Ku70-Ku80异源二聚体（Ku）在双链断裂（DSB）修复中起关键作用，但它在端粒区的持续存在却不引发有害的非同源末端连接（NHEJ），这个矛盾现象困扰了研究者二十余年。法国原子能与替代能源委员会（CEA）的Stéphane Marcand团队在《Nature Communications》发表的研究，终于揭开了这个谜团的关键部分。

研究团队发现端粒结合蛋白Rap1能直接调控Ku的功能状态。通过冷冻电镜首次捕捉到Rap1-DNA-Ku三元复合物的精细结构，显示Rap1像"门挡"般阻止Ku沿DNA内移——这是NHEJ启动的必要步骤。这种独特的抑制机制不依赖于蛋白竞争或直接相互作用，而是通过空间位阻实现功能转换，使Ku从"修复促进者"转变为"端粒守护者"。

关键技术包括：冷冻电镜解析复合物结构（分辨率达3.1?）、酵母遗传学筛选（利用I-SceI内切酶系统）、纳米孔测序分析端粒融合事件、电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白-DNA相互作用，以及质谱光散射测定复合物分子量。

NHEJ inhibition at a DSB by a single Rap1 molecule
实验证明单个Rap1结合位点（距断裂点11bp）即可显著抑制NHEJ效率（降低约80%），且该效应在缺乏辅助因子Rif2/Sir4时依然存在。通过设计不同距离和序列变体的对比实验，发现Rap1的保护作用具有严格的序列特异性和短程特征（<30bp有效）。

Rap1 and Ku co-binding at DNA ends
电泳迁移实验显示，当DNA延伸段≥4bp时，Rap1与Ku可形成稳定三元复合物。质谱光散射证实该复合物化学计量比为1:1:1，解离常数（K_d）在纳摩尔级别，与Ku对游离DNA末端的亲和力相当。

Structural analysis of Rap1 ability to restrict Ku's inward translocation
冷冻电镜结构揭示：在Rap1存在时，Ku仅能结合DNA末端5bp（β-桥区域），而在二元复合物中可结合18bp。关键发现是Rap1的Myb2亚域与Yku80形成两个微小接触区（距离<4?），但突变实验证实这些接触对功能抑制非必需，说明空间位阻是主要机制。

Significance at telomeres of Rap1 ability to restrict Ku's inward translocation
纳米孔测序发现：在Rap1充足细胞中，融合端粒的Rap1位点呈现双峰分布——距融合点2-4bp或>25bp的位点显著富集。这印证了体外结论：当Rap1距末端≤3bp时会与Ku竞争结合，而中间距离（4-25bp）最能有效抑制NHEJ。

这项研究阐明了端粒保护的"双保险"机制：理想情况下，Rap1允许Ku结合但限制其内移；极端情况下则直接竞争排斥Ku。这种精巧设计解决了"保护-复制"的矛盾——既不需要永久封闭末端影响复制，又能动态防止错误修复。该发现对理解癌症（端粒维持异常）和衰老（端粒缩短）相关疾病具有启示意义，并为开发靶向端粒保护的抗癌策略提供了新思路。研究还暗示类似机制可能存在于其他物种，因为Myb样DNA结合域在进化上高度保守。