揭示CRBN分子胶隐藏相互作用组的高通量蛋白质组学工作流程及其在靶向蛋白降解中的应用

本研究针对分子胶设计难题，开发了基于CRBN-DDB1ΔB的高通量亲和蛋白质组学平台，系统绘制了298种CRBN结合蛋白的互作图谱，发现包括PPIL4在内的新型非锌指靶点，并通过结构解析和化合物筛选验证了靶点可药性，为靶向蛋白降解(TPD)领域提供了重要资源和方法学突破。

　　

在药物研发领域，分子胶（molecular glue）作为一类能诱导蛋白质相互作用的小分子，正成为靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）领域的新宠。然而这类化合物的理性设计面临巨大挑战——就像拼图游戏缺少图纸，科学家们难以预测哪些蛋白质能被特定分子胶"粘合"到E3泛素连接酶上。更棘手的是，现有技术往往只能检测到最终被降解的蛋白质，却遗漏了大量虽能结合但未被降解的"沉默靶点"，这严重限制了分子胶药物的开发进程。

哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所的Kheewoong Baek等研究人员在《Nature Communications》发表的研究，如同为这个领域点亮了一盏探照灯。他们开发了一套创新的高通量亲和蛋白质组学工作流程，首次系统揭示了CRBN（Cereblon）分子胶的完整"社交网络"。这项研究不仅发现了298个与CRBN相互作用的蛋白质靶点，其中270个是此前未知的，更重要的是建立了一套从靶点发现到先导化合物优化的完整方法论。

研究团队采用了几个关键技术方法：1）基于CRBN-DDB1ΔB（去除了CUL4结合域的突变体）的亲和纯化-质谱（IP-MS）技术，在细胞裂解物中捕获分子胶诱导的蛋白质相互作用；2）自动化液体处理平台（Opentrons OT-2）实现96样本并行处理；3）数据非依赖采集（diaPASEF）质谱技术提高检测灵敏度；4）结合AlphaFold2预测和Rosetta计算模拟评估G-loop（甘氨酸环）结构兼容性；5）时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）和冷冻电镜验证靶点结合。

【Unbiased identification of degrader-induced interactors in-lysate】
研究人员首先验证了该方法的可靠性。使用沙利度胺类似物泊马度胺（pomalidomide）和激酶靶向降解剂SB1-G-187作为模型化合物，在MOLT4和Kelly细胞系中分别鉴定出11个和18个显著富集的靶蛋白。值得注意的是，与传统的全局蛋白质组学相比，这种方法能检测到更多间接结合的"搭便车"蛋白，如与激酶形成复合物的TAB1/TAB2。这揭示了分子胶可能通过"连带效应"影响整个蛋白质复合物网络。

【Mapping the interactomes of IMiD molecular glue degraders】
通过筛选20种IMiD类似物，研究绘制出迄今最全面的CRBN分子胶相互作用图谱。引人注目的是，除了已知的C2H2锌指蛋白（ZF）靶点外，还发现了大量含有RNA识别基序（RRM）和激酶结构域的新靶点。频率分析显示，PATZ1、ZBED3等蛋白在多个实验中反复出现，却未被传统降解实验检测到，提示它们可能是"只结合不降解"的特殊靶点。

【G-loop alignments as a computational filter for neo-substrate compatibility】
研究人员建立了计算分析流程，从AlphaFold2预测的46,040个G-loop结构中筛选出16,901个与CRBN兼容的候选靶点。特别值得关注的是，在47个验证的锌指蛋白靶点中，有42个具有可识别的G-loop结构，且冲突评分普遍较低，证实了该预测方法的可靠性。与降解数据的对比发现，仅约30%的结合靶点会发生实际降解，这为理解分子胶的作用机制提供了新视角。

【IMiD derived molecular glues recruit hundreds of non-zinc finger proteins】
研究打破了"CRBN只靶向锌指蛋白"的传统认知，发现251个非ZF靶点，包括激酶（IRAK1、TBK1）、代谢酶（ASS1）和剪接体调节因子PPIL4等。通过TR-FRET和体外泛素化实验验证了PDE6D、DTWD1和PPIL4的直接结合。冷冻电镜结构解析（3.4?分辨率）显示，FPFT-2216通过其三唑和甲氧基噻吩基团与PPIL4的G-loop（Gly278）特异性结合，揭示了新型分子识别机制。

【Discovery of a selective molecular glue for PPIL4】
作为方法学的示范应用，研究人员从6000多种IMiD类似物中筛选出选择性PPIL4分子胶Z6466608628。该化合物EC50达0.34μM，且特异性显著优于先导化合物FPFT-2216。结构分析表明其苯基哌嗪基团通过与CRBN的Glu377相互作用增强结合稳定性，为理性设计提供了模板。

这项研究的结论部分强调了几个关键突破：首先，建立的CRBN分子胶"靶点目录"将已知相互作用组扩大了近6倍；其次，揭示的"结合不降解"现象为理解分子胶耐药性提供了新思路；最后，针对PPIL4的先导化合物开发验证了该平台在药物发现中的实用价值。特别值得注意的是，研究中发现的RRM结构域蛋白靶点，为拓展分子胶的应用范围开辟了新方向。

从更广泛的角度看，这项工作不仅提供了宝贵的科学资源（所有数据已公开在https://v2.dfci-fischerlab.com/），更重要的是展示了一套可推广的研究范式——从高通量靶点发现，到计算预测验证，再到选择性分子胶开发。这种方法有望应用于其他E3连接酶的研究，加速靶向蛋白降解药物的开发进程。正如作者指出的，分子胶可能通过多种机制（包括非G-loop依赖方式）发挥作用，这为未来探索更丰富的诱导接近策略留下了广阔空间。